Kamis, 03 Maret 2011

MIKROBIOLOGI



*      Kompetensi: mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campurannya sehingga didapat kultur murni.
*      Isolasi Mikroorganisme:
a. Pengertian
b. Teknik Pengambilan sampel
c. Isolasi dengan cara pengenceran
1) Teknik preparasi suspensi
· Swab
· Rinse
· Maserasi
2) Teknik pengenceran bertingkat
3) Teknik penanaman
· Dari suspensi (spread dan pour plate)
· Dengan goresan (streak dan quadrant streak inoculation)
d. Prosedur isolasi bakteri dari sampel
e. Prosedur isolasi jamur dari sampel
*      Pengertian
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri inidapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
*      Teknik Pengambilan Sampel
Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel.


1. Sampel tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika yang diinginkan
mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran..
2. Sampel air
Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.
Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)
1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel :
a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.
b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass.

c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Unutk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi

1. Teknik Pengenceran Bertingkat
Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.

Cara Kerja :
a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping)
b. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama.

3. Teknik Penanaman
a. Teknik penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.
a.1. Spread Plate (agar tabur ulas)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut :
· Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat.
· Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.
· Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.
· Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.
a.2. Pour Plate (agar tuang)
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut :
· Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC)
· Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong
· Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.
Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1 ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.


b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru.
b.1 Goresan Sinambung
Cara kerja :
· Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar.
· Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis.
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
b.2 Goresan T
Cara kerja :
· Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker
· Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag
· Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna
· Lakukan hal yang sama pada daerah 3
B.3 Goresan Kuadran (Streak quadrant)
Cara kerja :
Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.
Cara Kerja Isolasi Bakteri dari Sampel Tanah :
· Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8
· Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate pada medium NA, setelah selesai, diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam
· Koloni akan tumbuh pada ketiga cawan tersebut kemudian dipilih koloni yang relatif terpisah dari koloni lain dan koloni yang mudah dikenali
· Koloni yang terpilih kemudian ditumbuhkan atau dimurnikan ke NA baru dengan teknik streak kuadran
· Inkubasi 1x24 jam.
Cara Kerja Isolasi Jamur dari Tanah :
·                 Tanah dalam cawan petri dipanaskan dengan oven pada suhu 80oC selama 30 menit dengan cawan petri untuk membunuh sel vegetatiftetap bertahan
·                 Tanah yang telah dioven diambil 1 g kemudian dimasukan ke dalam tabung pengenceran bertingkat
·                 Tiga pengenceran terakhir diambil untuk ditanama secara spread plate ke media PDA yang ditambah streptomycin atau penicillin. Kemudian diinkubnasi pada suhu ruang 5-7 hari
·                 Koloni jamur yang tumbuh dimurnikan dan ditanam pada medium PDA baru,
·                 Inkubasi pada suhu ruang 5-7 hari.

 

 

 

 

 

 


VIBRIO

BAB I
PENDAHULUAN


1.1 Latar Belakang
Mikroba di alam hampir terdapat di semua tempat. Di udara mulai dari permukaan tanah sampai lapisan atmosfir yang paling tinggi. Di laut terdapat sampai di dasar laut yang paling dalam. Di alam air seperti di air sungai, selokan, kolam atau air sawah. Pada tanah yang subur, kira-kira terdapat 50 juta bakteri per gram tanah.

Mikroba terdapat ditempat dimana manusia hidup. Terdapat pada udara yang kita hirup, pada makanan yang kita makan, juga terdapat pada permukaan kulit, pada jari tangan, pada rambut, dalam rongga mulut, usus, pada saluran pernapasan dan pada seluruh permukaan tubuh yang terbuka dan dianggap sebagai flora normal. Pada setiap sentimeter persegi kulit terdapat sekitar 10.000 sampai dengan 100.000 ribu bakteri.

Masuknya mikroba kedalam jaringan tubuh, kemudian berkembang biak dan menimbulkan gejala penyakit disebut infeksi. Gejala klinik sebagai akibat adanya infeksi bisa sembuh kembali secara sempurna (kelainan pathologinya reversibel).

Bakteri adalah organisme yang paling banyak jumlahnya dan lebih tersebar luas dibandingkan makhluk hidup yang lain. Bakteri memiliki ratusan ribu spesies yang hidup di darat hingga lautan dan pada tempat-tempat yang ekstrim. Bakteri ada yang menguntungkan tetapi ada pula yang merugikan. Bakteri memiliki ciri-ciri yang membedakannya dengan makhluk hidup yang lain. Bakteri adalah organisme uniselluler dan prokariot serta umumnya tidak memiliki klorofil dan berukuran renik atau mikroskopik (http://makalah biologiku.com).

Bakteri adalah salah satu makhluk hidup yang sangat kecil yang hanya dapat dilihat melalui mikroskop, tetapi memilki peran yang sangat penting dalam kehidupan yaitu dapat menguraikan makhluk hidup. Bisa kita bayangkan jika seandainya tidak ada makhluk hidup yang dapat menguraikan maka dunia ini akan penuh dengan timbunan pepohonan, dedaunan dan makhluk hidup karena tidak adanya proses penguraian oleh makhluk kecil ini.
Bakteri terdapat ditempat dimana manusia hidup. Terdapat pada udara yang kita hirup, pada makanan yang kita makan, juga terdapat pada permukaan kulit, pada jari tangan, pada rambut, dalam rongga mulut, usus, dalam saluran pernafasan dan pada seluruh permukaan yang terbuka dan dianggap sebagai flora normal.
Tapi kadang-kadang pula dalam keadaan tertentu, misalnya pada saat daya tahan tubuh lemah bakteri komensal maupun bakteri mutualistik bisa menimbulkan penyakit. Bila suatu jenis bakteri dilihat dengan mikroskop akan tampak jelas dengan melalui proses pewarnaan. Pewarnaan bakteri dapat dilakukan dengan satu atau lebih zat warna. Pewarnaan bakteri dengan menggunakan lebih dari satu zat warna diberi nama sesuai dengan penemunya.

1.2 Maksud dan Tujuan
Maksud dari penyusunan laporan praktikum ini adalah untuk mengidentifikasi Vibrio sp pada sampel es kelapa muda gerobak 4 depan Telkom Pettarani.

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk dapat mengisolasi bakteri yang terdapat pada sampel es kelapa muda gerobak 4 depan Telkom Pettarani dan untuk mengidentifikasi penyakit yang ditimbulkannya.

1.3 Kerangka Operasional
Pewarnaan gram Pewarnaan flagella
Inkubasi 370 selama 24 jam
Inkubasi 370C selama 24 jam
Pewarnaan gram Pewarnaan flagella

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tinjauan umum Vibrio sp
Bakteri Vibrio sp adalah jenis bakteri yang dapat hidup pada salinitas yang relatif tinggi. Menurut Rheinheiner (1985) cit. Herawati (1996), sebagian besar bakteri berpendar bersifat halofilik yang tumbuh optimal pada air laut bersalinitas 20-40‰. Bakteri Vibrio berpendar termasuk bakteri anaerobic fakultatif, yaitu dapat hidup baik dengan atau tanpa oksigen. Bakteri Vibrio tumbuh pada pH 4 - 9 dan tumbuh optimal pada pH 6,5 - 8,5 atau kondisi alkali dengan pH 9,0 (Baumann et al., 1984 cit. Herawati, 1996).
Vibrio sp merupakan salah satu bakteri patogen yang tergolong dalam divisi bakteri, klas Schizomicetes, ordo Eubacteriales, Famili Vibrionaceae. Bakteir ini bersifat gram negatif, fakultatif anaerob, fermentatif, bentuk sel batang dengan ukuran panjang antara 2-3 µm, menghasilkan katalase dan oksidase dan bergerak dengan satu flagella pada ujung sel (Austin, 1988).

Pencemaran limbah dalam suatu perairan mempunyai hubungan dengan jenis dan jumlah mikroorganisme dalam perairan tersebut. Air buangan kota dan desa yang berpenduduk padat tidak hanya meningkatkan pertumbuhan bakteri koliform akan tetapi juga meningkatkan jumlah bakteri patogen seperti Salmonella, Shigella dan Vibrio cholera (Shuval, 1986).

Infeksi pada luka mungkin ringan tetapi sering berlanjut dengan cepat (setelah beberapa jam), dengan perkembangan lesi kulit bullous, selulitis, dan miositis dengan nekrosis. Karena cepatnya kemajuan dari infeksi, maka diperlukan pengobatan antibiotic sesuai sebelum konfirmasi dengan kultur didapat. Diagnose didapat melalui kultur organisme pada media laboratorium standar (Jawetz, dkk. 2005).

2.2. Klasifikasi Vibrio
Kingdom : Eubacteria
Divisi : Bacteri
Class : Schizomycetes
Ordo : Eubacteriales
family : Vibrionaceae
Genus : Vibrio
Spesies : Vibro anguillarum Vibrio vulnificus
Vibrio salmonicida Vibrio hollisae
Vibrio alginolyticus Vibrio damsel
Vibrio cholera Vibrio fluvialis
V. parahaemolyticus Vibrio mimicus
2.3. Morfologi dan Identifikasi
2.3.1 Ciri khas organism
Vibrio
Secara umum, morfologi atau struktur tubuh dari bakteri Vibrio bila diisolir dari faeces penderita atau dari biakkan yang masih muda adalah batang bengkok seperti koma, tetapi akan berbentuk batang lurus bila diambil atau didapat dari biakan yang sudah tua.
Mempunyai sifat Gram negatif dengan ukuran 1 – 3 x 0,4 – 0,6 µm tetapi ada beberapa literatur yang mengatakan bahwa Vibrio berukuran panjang (1,4 – 5,0) µm dan lebar (0,3 – 1,3) µm.

2.3.2 Biakan
Berdasarkan pengamatan visual terhadap bakteri pathogen spesies Vibrio, maka bakteri ini dapat dibedakan berdasarkan warna, bentuk, dan ukuran koloni yang tumbuh pada media TCBS agar setelah masa inkubasi 24 - 48 jam pada suhu kamar (30°C). TCBS adalah media yang lebih dianjurkan untuk kultur tinja, dimana sebagian besar galur menghasilkan koloni-koloni yang berwarna biru-hijau (sukrosa negatif). (Jawetz, dkk. 2005).
Dari hasil penelitian terhadap isolat bakteri Vibrio sp, ditemukan enam spesies bakteri patogen Vibrio sp, yaitu :
a. Vibrio Anguillarum
Mempunyai ciri-ciri warna putih kekuning-kuningan, bulat, menonjol dan berkilau. Karakteristik biokimia adalah mempunyai sifat fermentatif, katalase, oksidase, glukosa, laktosa, sellobiosa, galaktosa dan manitol positif. Sedangkan methyl red dan H2S negatif.
b. Vibrio alginolyticus.
Mempunyai ciri-ciri berwarna kuning, diameter 3-5 mm. Karakteristik biokimia adalah mempunyai sifat fermentatif, katalase, oksidase, methyl red dan H2S, glukosa, laktosa, dan manitol positif. Sedangkan sellobiosa, fruktosa, galaktosa negatif.
c. Vibrio cholera
Mempunyai ciri-ciri yaitu berwarna kuning, datar, diameter 2-3 mm, warna media berubah menjadi kuning. Karakteristik biokimia adalah mempunyai sifat fermentatif, katalase, oksidase, methyl red dan H2S, glukosa, laktosa, galaktosa dan manitol positif. Sedangkan sellobiosa, fruktosa, bersifat negatif.
d. Vibrio salmonicida
Mempunyai ciri-ciri berwarna bening, diameter < 1 mm, bulat, menonjol dan utuh. Karakteristik biokimia adalah mempunyai sifat fermentatif, katalase, oksidase, glukosa positif. Sedangkan methyl red, H2S, laktosa, galaktosa, manitol, sellobiosa, fruktosa, bersifat negatif.
e. Vibrio vulnificus.
Mempunyai ciri-ciri berwarna biru sampai hijau, diameter 2-3 mm. Karakteristik biokimia adalah mempunyai sifat fermentatif, katalase, oksidase, methyl red dan H2S glukosa, sellobiosa, fruktosa, galaktosa dan manitol positif. Sedangkan, laktosa bersifat negatif.
f. Vibrio parahaemolyticus.
Mempunyai ciri-ciri berwarna biru sampai hijau, diameter 3- 5 mm, dipusat koloni berwarna hijau tua. Karak-teristik biokimia adalah mempunyai sifat fermentatif, katalase, oksidase, glukosa, laktosa, galaktosa dan manitol positif. Sedangkan sellobiosa, fruktosa, methyl red dan H2S bersifat negatif. Vibrio parahaemolyticus (Vp) merupakan bakteri halofilik Gram negatif.Bakteri ini tumbuh pada kadar NaCl optimum 3%, kisaran suhu 5 – 43°C,pH 4.8 – 11 dan aw 0.94 – 0.99.Pertumbuhan berlangsung cepat pada kondisi suhu optimum (37°C) dengan waktu generasi hanya 9–10 menit.Seafood yang merupakan produk hasil laut, memberikan semua kondisi yang dibutuhkan oleh Vp untuk tumbuh dan berkembang biak: keberadaan garam, nutrien yang baik serta pH dan aw yang cocok sehingga Vp sering terdapat sebagai flora normal di dalam seafood. Mereka terkonsentrasi dalam saluran pencernaan moluska, seperti kerang, tiram dan mussel yang mendapatkan makanannya dengan cara mengambil dan menyaring air laut .Strain Vp patogen merupakan penyebab penyakit gastroenteritis yang disebabkan oleh produk hasil laut ( seafood ), terutama yang dimakan mentah, dimasak tidak sempurna atau terkontaminasi dengan seafood mentah setelah pemasakan. Gastroenteritis berlangsung akut, diare tiba-tiba dan kejang perut yang berlangsung selama 48 – 72 jam dengan masa inkubasi 8 – 72 jam. Gejala lain adalah mual, muntah, sakit kepala, badan agak panas dan dingin. Pada sebagian kecil kasus, bakteri juga menyebabkan septisemia. Sejak tahun 1997, jumlah kasus Kejadian Luar Biasa (KLB) yang disebabkan oleh Vp meningkat secara tajam di berbagai kawasan dunia.Terjadinya KLB ini telah teridentifikasi disebabkan oleh konsumsi seafood terutama tiram ( oyster ) mentah yang terkontaminasi oleh Vp.Sejak tahun 1997 tersebut, maka seafood terutama tiram dianggap sebagai jenis pangan yang penting diwaspadai dari aspek keamanan pangan.Strain Vp patogen penyebab gastroenteritis sangat beragam.Strain Vp patogen dengan serotype O3:K6 sejak tahun 1996 muncul menjadi sumber patogen baru penyebab keracunan pangan. Kasus keracunan karena Vp lebih banyak terjadi pada musim panas.Kondisi ini berkorelasi positif dengan prevalensi dan jumlah kontaminasi Vp pada sampel seafood lingkungan yang juga meningkat dengan meningkatnya suhu perairan.Tingkat salinitas air laut juga berpengaruh pada tingkat kontaminasi. Teknik analisis berpengaruh pada tingkat prevalensi dan tingkat isolasi Vp dari seafood. Untuk pengendalian tingkat kontaminasi didalam seafood, diperlukan pemilihan metode analisis yang lebih sensitifitas dengan waktu deteksi yang lebih cepat.Teknik analisis berdasarkan deteksi gen (tlh, tdh dan/atau trh) memberikan hasil yang lebih akurat untuk mendeteksi strain patogen dibandingkan dengan teknik MPN-konvensional yang berdasarkan pada reaksi biokimiawi. Pada sampel seafood dari lingkungan dan pasar ritel, Vp patogen hanya terdeteksi dalam jumlah rendah (<100 sel per-gram).Prevalensi dan tingkat kontaminasi Vp dalam sampel seafood lingkungan dan pasar ritel juga seringkali jauh lebih kecil dari batas maksimum Vp yang diijinkan FDA didalam seafood yang akan dijual (104 sel per-gram).Kondisi ini juga terjadi pada sampel yang diambil selama terjadinya (www.google.com).
Atau dapat dilihat dari kolom dibawah ini :
NO MEDIA CHOLERA ELTOR PARAHAEM NAG
1 Simmon’s citrate Positif Positif Positif Positif
2 Urea agar Negatif Negatif Negatif Negatif
3 Lysine iron agar Positif Positif Positif Positif
4 TCBS Kuning Kuning Hjau Kuning
5 Glucose Asam Asam Asam Asam
6 Lactose Alcalis Alcalis Alcalis Alcalis
7 Manniet Asam Asam Asam Asam
8 Maltose Asam Asam Asam Asam
9 Sacharose Asam Asam Alcalis Asam
10 Oxydatie test Positif Positif Positif Positif
11 Stiring test Positif Positif Positif Positif
12 Haemolysa test Negatif Positif Negatif ?
13 Haemagglutinasi Negatif Positif Negatif ?
14 Polymixin B test Sensitif Resistent Resistent ?
15 Phage test Sensitif Resistent Resistent Resistent

2.4. Media Perbenihan Vibrio sp
Bakteri Vibrio adalah jenis bakteri yang dapat hidup pada salinitas yang relatif tinggi. Menurut Rheinheiner (1985) cit. Herawati (1996), sebagian besar bakteri berpendar bersifat halofil yang tumbuh optimal pada air laut bersalinitas 20-40‰. Bakteri Vibrio berpendar termasuk bakteri anaerobic fakultatif, yaitu dapat hidup baik dengan atau tanpa oksigen. Bakteri Vibrio tumbuh pada pH 4 - 9 dan tumbuh optimal pada pH 6,5 - 8,5 atau kondisi alkali dengan pH 9,0 (Baumann et al., 1984 cit. Herawati, 1996).

Media yang sering digunakan adalah sebagai berikut (Soemarno, 1962).
1) T.C.B.S. Agar plate
Biasanya koloni Vibrio yang tumbuh pada media ini berwarna kuning, koloni sedang - besar, smooth, keping,jernih,tepinya tipis, dilingkari oleh zone berwarna kuning, ada yang koloninya berwarna hijau.
2) Mac Conkey agar
Koloni Vibrio yang tumbuh pada media Mac conkey berukuran kecil-kecil, tidak berwarna atau merah muda dan sedikit cembung.

Beberapa test yang biasa dilakukan yaitu sebagai berikut (Soemarno, 1962):
TSIA : Lereng : Alkali
Dasar : kuning
Gas : (+)positif
SIM : Sulfur : (-)negatif
Indol : (+/-) positif/negatif
motility : Aktif
SC : (+/-) positif/negatif
Oxidase test ; (+)
Glucose OF : Fermentative
String test : (+)
Catalase test : (-)negative

2.5. Sifat Patogenitas dan Gejala Klinis
Dalam keadaan alamiah, bakteri ini hanya patogen terhadap manusia, tetapi secara eksperimen dapat juga menginfeksi hewan. Hewan laut yang telah terinfeksi Vibrio khususnya Udang, akan mengalami kondisi tubuh lemah, berenang lambat, nafsu makan hilang, badan mempunyai bercak merah-merah (red discoloration) pada pleopod dan abdominal serta pada malam hari terlihat menyala. Udang yang terkena vibriosis akan menunjukkan gejala nekrosis. Serta bagian mulut yang kehitaman adalah kolonisasi bakteri pada esophagus dan mulut. Vibrio tidak bersifat invasif, yaitu tidak pernah masuk kedalam sirkulasi darah tetapi menetap di usus sehingga dapat menyebabkan gastritis pada manusia. Masa inkubasi bakteri ini antara 6 jam sampai 5 hari. Vibrio menghasilkan enterotoksin yang tidak tahan asam dan panas, musinase, dan eksotoksin. Toksin diserap dipermukaan gangliosida sel epitel dan merangsang hipersekresi air dan klorida sehingga menghambat absorpsi natrium. Akibat kehilangan banyak cairan dan elektrolit, terjadilah kram perut, mual, muntah, dehidrasi, dan shock (turunnya laju aliran darah secara tiba-tiba). Kematian dapat terjadi apabila korban kehilangan cairan dan elektrolit dalam jumlah besar. Penyakit ini disebabkan karena korban mengkonsumsi bakteri hidup, yang kemudian melekat pada usus halus dan menghasilkan toksin. Produksi toksin oleh bakteri yang melekat ini menyebabkan diare berair yang merupakan gejala penyakit ini. Proses ini dapat dibuktikan dengan pemberian viseral antibodi. Bila terjadi dehidrasi, maka diberikanlah cairan elektrolit. Immunitas pasif dapat dilakukan dengan memberikan viseral antibodi dan viseral antitoksin yang dapat mengurangi cairan tanpa mematikan kuman. Vibrio jenis lain juga dapat menghasilkan soluble hemolysin yang dapat melisiskan sel darah merah. Struktur antigen Vibrio baik yang patogen maupun nonpatogen memiliki antigen-H tunggal yang sejenis dan tidak tahan panas. Antigen-H ini sangat heterogen dan juga banyak terjadi overlapping dengan bakteri lain. Gartnor dan Venkatraman membagi antigen-O Vibrio menjadi grup O1-O6. Yang patogen bagi manusia adalah grup O1 dari Vibrio coma. Antibodi terhadap antigen-O bersifat protektif sehingga Ogawa, Inaba, dan Hikojima membagi tiga serotip yang mewakili tiga faktor gen yaitu A, B, dan C. Serotip Hikojima atau serotip ketga merupakan campuran antara Ogawa dan Inaba. Atau untuk lebih jelasnya perhatikan tabel berikut :
Serotip Faktor O
Ogawa AB
Inaba AC
Hikojima ABC

Masa inkubasi bakteri ini antara 6 jam sampai 5 hari. Pada Vibrio parahaemolyticus gejala berlangsung sampai 10 hari, rata-rata 72 jam. Sumber penularannya adalah melalui air, makanan, dan minuman yang terkontaminasi oleh lalat. Serta hubungan antar manusia, yaitu orang yang sedang sakit, orang yang telah sembuh dari penyakit, dan orang yang tidak pernah sakit tetapi membawa bibit penyakit atau healthy carrier. Penyebarannya juga bisa melalui air yang tercemar, bakteri ini termasuk jenis opportunistic pathogen yang dalam keadaan normal ada dalam lingkungan pemeliharaan, kemudian berkembang dari sifat yang saprofitik menjadi patogenik jika kondisi lingkungannya memungkinkan. Bakteri Vibrio yang patogen dapat hidup di bagian tubuh organisme lain baik di luar tubuh dengan jalan menempel, maupun pada organ tubuh bagian dalam seperti hati, usus dan sebagainya. Menurut Wagiyo (1975) dampak langsung bakteri patogen dapat menimbulkan penyakit, parasit, pembusukan DNA toksin yang dapat menyebabkan kematian biota yang menghuni perairan tersebut.Jika semua ikan dan hewan laut mati atau terkena vibriosis, maka akan menyebabkan penyakit bagi manusia yang memakannya dengan gejala awal seperti mual, muntah, diare, dan kejang perut sehingga bila terjadi secara terus menerus dapat menyebabkan kehilangan cairan dan elektorlit secara berlebihan, dehidrasi, kolaps sirkulasi, dan anuri. Penyakit ini biasanya hanya dianggap sebagai diare biasa dan masyarakat hanya menganggap remeh serta tidak ditindaklanjuti atau tidak segera diobati sehingga dapat didapatkan angka kematian tanpa pengobatan sebanyak 25-50%. Di Jepang, 5% diare disebabkan oleh Vibrio parahaemolyticus(www.google.com).

2.6. Resistensi
Antibiotik merupakan suatu senyawa kimia yang sebagian besar dihasilkan oleh mikroorganisme, karakteristiknya tidak seperti enzim, dan merupakan hasil dari metabolisme sekunder. Penggunaan antibiotik yang berlebih pada tubuh manusia dapat menyebabkan resistensi sel mikroba terhadap antibiotik yang digunakan. Resistensi sel mikroba adalah suatu sifat tidak terganggunya sel mikroba oleh antibiotik. Sejumlah isolat Vibrio yang diisolasi dari udang ternyata resisten terhadap berbagai macam antibiotik seperti spektinomisin, amoksisilin, kloramfenikol, eritromisin, kanamisin, tetrasiklin, ampisilin, streptomisin, dan rifampisin(google.com).

2.7. Pengobatan
Mengatasi terjadinya dehidrasi dengan pemberian pediatric cholera solution yang banyak mengandung K+ dan HCO3?. Pemberian antibiotic tetrasiklin yang dapat mempersingkat masa pemberian caira atau rehirdasi. Sedangkan pada Vibrio parahaemolyticus adalah dengan pemberian antibiotika kloramfenikol, kanamisin, tetrasiklin, dan sefalotin(www.google.com).
2.8. Pencegahan
à Pendidikan kesehatan (health education)
à Perbaikkan sanitasi khususnya control terhadap vector lalat
à Vaksinasi dapat melindungi orang-orang yang kontak langsung dengan penderita. Berapa lama efek proteksinya belum diketahui. Untuk mengatasi epidemic, efeknya belum jelas. Yang penting adalah efek psikologisnya.
à Diadakan perhatian khusus kepada pekerja-pekerja kapal, perenang, dan juru masak seafood karena habitat dari bakteri ii adalah di laut.
à Pengolahan dan penyimpanan makanan laut harus cermat.

BAB III
METODE KERJA


3.1 Tujuan Pemeriksaan
Untuk mengetahui langkah-langkah yang perlu dilakukan dalam mengidentifikasi Vibrio sp.

3.2 Alat dan Bahan
Alat  :
Objeck Glass Autoclave
Ose Bulat Tabung Reaksi
Ose Lurus Pipet Tetes
Lampu Spiritus Botol
Mikroskop
Reagen  :
Carbol Gentian Violet Indicator Methyl Red
Lugol Indikatot BTB
Alcohol 96% α – Naphtol 1 %
Air Fuchsin KOH 1%
Sampel :
Air Es Kelapa Gerobak 4 Depan Telkom Pettarani.
Media  :
- TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose)
- MC (Mac Conkey)
- TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
- Media Biokimia (MR/VP, SIM, Gula-gula, Urea, SCA)


3.3 Prosedur Kerja Pemeriksaan Vibrio sp
à Hari I
§ Specimen urin di centrifuge kemudian supernatannya dilakukan pewarnaan gram.
§ Dengan specimen yang sama, diambil dengan menggunakan ose steril untuk kemudian ditanam pada media BHIB pada suhu 37o C selama 24 jam.

à Hari II
Bakteri yang tumbuh pada media BHIB ditanam dengan menggunakan ose steril pada media TCBS dan Mac conkey.Semua media yang telah ditanami diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37o C.
à Hari III
§ Koloni tersangka yang ditanam pada media selektif TCBS, kemudian ditanam pada media differensial Triple Sugar Iron Agar (TSIA). Diinkubasikan selama 1x24 jam suhu 37°C
à Hari IV
§ Dengan koloni yang sama, ditanam pada media gula-gula (glukosa, sukrosa, manitol, maltose dan laktosa ) , media MR/VP, SC dan SIM
§ Semua media yang telah ditanami dengan biakan, diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam.
à Hari V
§ Media selektif TCBS dan media uji biokimia (gula-gula, SIM, MR/VP, SC, TSIA ) diamati pertumbuhannya.
§ Untuk media SIM, ditambahkan dengan reagen Covac’s
§ Untuk media MR, ditambahkan dengan reagen Metil Red
§ Untuk media VP, ditambahkan dengan KOH 10 % dan α-naftol
§ Hasil pengamatan, disesuaikan dengan table pengamatan biokimia untuk menentukan spesies bakteri Vibrio

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
ü Hari ke I
Hasil pewarnaan gram
Bakteri gram negatif (-)
Bentuk koma

Hasil Penanaman pada media TCBS dan MC
TCBS MC
Ciri-ciri koloni :
TCBS : Koloni sedang-besar, berwarna hijau, jernih, smooth, keping, tepinya tipis, ada koloni yang berwarna kuning dengan zona yang berwarna kuning juga.
MC : Koloni kecil-kecil, sedikit cembung, tidak berwarna atau merah muda, smooth.
ü Hari ke II
Hasil penanaman pada media differensial TSIA
Alkali
Acid
ü Hari ke III
Hasil Uji Biokimia
Media gula-gula

Ket :
• MR = Positif (+)
• SIM Sulfur = Negatif (-)
Indol = Positif (-)
Motiliti = Positif (+)

• SCA = Positif (+)
• Gula-gula = Glukosa (+), laktosa (+), maltosa (+), fruktosa (+), mannitol (+).
• TSIA = alkali-acid, gas (-), H2S (-)

4.2 Pembahasan

• Pewarnaan :
Bakteri terlihat berbentuk basil bengkok berwarna merah, hal ini menandakan bahwa bakteri tersebut mengikat zat warna merah dari safranin.
• Media – media Perbenihan :
TCBS :
MC :
• Media Differensial dan Uji Biokimia :
TSI Agar
Pada pengamatan, terlihat lereng yang berwarna merah sedangkan dasarnya berwarna kuning (alkali-acid). Hal ini menandakan bakteri yang tumbuh pada media ini hanya mampu memfermentasi glukosa (bagian dasar) dan tidak mampu memfermentasi laktosa dan sukrosa (bagian lereng).

Gula-gula
Media ini berfungsi untuk melihat kemampuan bakteri memfermentasikan jenis karbohidrat, jika terjadi fermentasi maka media terlihat berwarna kuning kerena perubahan pH menjadi asam. Vibrio sp memfermentasikan semua gula-gula menjadi asam.

SIM :
S (sulfur). Adanya sulfur dapat dilihat ketika media berubah menjadi hitam. Namun pada hasil pertumbuhan bakteri pada media ini, tidak terjadi perubahan warna tersebut. Hal ini menandakan bakteri yang tumbuh tidak mampu mendesulfurasi cysteine yang terkandung dalam media SIM.
I (indol). Reaksi indol hanya bisa dilihat ketika pertumbuhan bakteri pada media ini ditambahkan dengan reagen Covac’s. Indol dikatakan positif jika terdapat cincin merah pada permukaannya. Warna merah dihasilkan dari resindol yang merupakan hasil reaksi dari asam amino tryptopan menjadi indol dengan penambahan Covac's. Bakteri yang mampu menghasilkan indol menandakan bakteri tersebut menggunakan asam amino tryptopan sebagai sumber carbon. Pada hasil pengamatan diperoleh Indol negative sehingga dapat disimpulkan bakteri yang tumbuh tidak menggunakan asam amino tryptopan sebagai sumber carbonnya.
M (motility). Pergerakan bakteri dapat terlihat pada media ini berupa berkas putih di sekitar tusukan. Adanya pergerakan ini bisa dilihat karena media SIM merupakan media yang semi solid. Pada hasil pengamatan diperoleh motility positif. Hal ini menandakan bakteri mempunyai alat gerak dalam proses pertumbuhannya.

MR (Methyl Red)
Setelah ditambahkan dengan indicator metil red, media berubah menjadi merah (positif). Berarti terjadi fermentasi asam campuran (asam laktat, asam asetat, dan asam formiat) oleh bakteri.

BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil praktikum dan identifikasi yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa sampel es kelapa muda gerobak 4 depan Telkom Pettarani yang diperiksa terdapat bakteri Vibrio anguillarum dalam sampel.

5.2 Saran
Dalam melakukan pemeriksaan pada specimen, perlu memperhatikan prosedur kerja tetap identifikasi bakteri Vibrio, agar hasil identifikasi yang diperoleh murni dari satu genus bakteri yang diinginkan.


Prinsip :
Melakukan penusukkan pada bagian ujung jari secara aseptis untuk mendapatkan sempel darah perifer.

Alat – alat / bahan :

1. Lancet steril.
2. Kapas alkohol.
3. Tabung penampung ukuran mikro.
4. Kapas kering.
5. Mikropore.
6. Penghangat tumit ( handuk hangat dsb ).

Cara kerja :
1. Dibersihkan dengan kapas alkohol 70 % bagian yang akan ditusuk, biarkan kering dengan sendirinya.
2. Bagian jari yang akan ditusuk dipegang agar tidak bergerak dan jangan diremas.
3. Tusuk dengan cepat memakai lancet steril dengan posisi lancet tegak lurus.
4. Tetes darah pertama dilap dengan kertas kering, tetes berikutnya diperlukan sebagai sempel sesuai keperluan pemeriksaan.
5. Setelah selesai diambil darahnya, bekas luka ditutup dengan kapas kering dan diplester dengan mikropore.







Pembahasan :
1. Pada orang dewasa diambil pada ujung jari tangan kedua, ketiga dan keempat, anak daun telinga, pada anak – anak dan bayi diambil pada bagian ibu jari kaki dan tumit.
2. Tusuklah agak dalam agar darah mudah keluar ( ± 2.4 mm ).
3. Jangan menekan jari, telinga atau tumit yang ditusuk untuk mendapatkan darah karena akan bercampur dengan cairan jaringan.
4. Jangan menusuk pada bagian yang sudah pernah diambil.
5. Jangan menusuk paralel dengan guratan sidik jari, sebab darah akan mengalir kebawah jari dan akan sulit ditampung.
6. Jika bagian tubuh yang akan diambil terasa dingin jangan ditusuk sebab darah yang akan keluar akan sedikit, sebaiknya dihangatkan dahulu.

Kesimpulan :
Sampling darah sangat dipengaruhi pemeriksaan, untuk itu hindari darah yang beku dan bercampur cairan jaringan serta hindari teknik pengambilan yang kurang baik.







 



A. Pembuatan Larutan HCl 0,1 N
v Alat dan Bahan
ü Alat :
- Karet penghisap
- Labu ukur
- Pipet takar
- Pipet tetes
- Gelas ukur
- Botol reagen
ü Bahan :
- HCl 37 %
- Aquadest

v Perhitungan
N. larutan induk (N1) = 12,06

ü ml larutan yang dipipet
N1 x V1 = N2 x V2
12,06 x V1 = 0,1 x 100
V1 = 10_
12,06
V1 = 0,829 ml = 0,83 ml

v Prosedur Kerja
1. Siapkan alat dan bahan yang diperlukan dengan lengkap.
2. Pipet HCl 37% sebanyak 0,83 ml dengan menggunakan pipet takar.
3. Masukkan ke dalam labu ukur 100 ml yang sebelumnya telah diisi dengan sedikit aquadest.
4. Tambahkan aquadest hingga mencapai tanda batas.
5. Kenudian kocok larutan hingga homogen.
6. Pindahkan secara kuantitatif ke dalam botol reagen.
7. Berikan label yang berisi keterangan : nama larutan, tgl. Pembuatan, dan pembuatnya.
8. Setelah selesai, bersihkan semua alat yang telah dipergunakan.

v Kesimpulan
Jadi, untuk membuat larutan HCl 0,1 N dibutuhkan HCl 37% sebanyak 0,8 ml.

B. Pembuatan Larutan Turk
v Alat dan Bahan
ü Alat
- Pipet volume
- Labu ukur
- Kaca arloji
- Gelas ukur
- Beaker gelas
- Corong
- Kertas saring
- Batang pengaduk
- Botol reagen
ü Bahan
- Larutan gentian violet 1% dalam air 1 ml.
- Asam asetat glasial ( CH3COOH ) 1 ml
- Aquadest 100 ml
v Prosedur Kerja
1. Siapkan alat dan bahan yang diperlukan dengan lengkap.
2. Timbang semua bahan satu per satu sesuai dengan yang diperlukan.
3. Tuang semua bahan ke dalam gelas kimia.
4. Larutkan dahulu dengan sedikit aquadest, aduk dengan menggunakan batang pengaduk.
5. Pindahkan larutan ke dalam labu ukur 100 ml.
6. Tambahkan aquadest sampai tanda batas, kocok sampai larutan menjadi homogen.
7. Pindahkan isi labu secara kuantitatif ke dalam botol reagen, berilah keterangan : nama larutan. Tgl.pembuat, pembuatnya.
8. Bersihkan alat – alat yang telah dipergunakan.

C. Pembuatan Larutan Hayem
v Alat dan Bahan
ü Alat :
- Cawan poselen
- Labu ukur
- gelas ukur
- pipet tetes
- beaker gelas
- sendok tanduk
- Neraca
- Corong
- Kertas saring
- Botol reagen
ü Bahan :
- Na2SO4 (berair kristal) 5 gr
- NaCl 1 gr
- HgCl (Merkuri Chlorida) 0,5 gr
- Aquadest 200 m

v Prosedur Kerja
1. Siapkan alat dan bahan yang diperlukan dengan lengkap.
2. Timbang semua bahan satu per satu seduai deangan yang diperlukan.
3. Tuang semua bahan ke dalam beaker gelas, bersihkan cawan porselen dengan aquadest.
4. Larutkan dahulu dengan sedikit aquadest,aduk dengan menggunakan batang pengaduk.
5. Pindahakan ke dalam labu ukur 100 ml.
6. Tambahkan aquadest sampai tanda batas, kemudian kocok larutan hingga homogen.
7. Pindahkan secara kuantitatif ke dalam botol reagen, berilah keterangan : nama larutan, tgl. pembuatan, pembuatnya.
8. Bersihkan semua alat – alat yang telah dipergunakan.

D. Pembuatan Larutan EDTA 10 %
v Alat dan Bahan
ü Alat :
- Sendok tanduk
- Cawan porselen
- Gelas ukur
- Pipet tetes
- Beaker glass
- Batang pengaduk
- Corong
- Neraca
- Botol reagen
ü Bahan :
- EDTA (Etilen Diamin Tetra Acetat)
- Aquadest



v Perhitungan
10 % =
Berat = 0,1 x 100 =  10 gram

v Prosedur Kerja
1. Siapkan alat dan bahan yanfgdiperlukan dengan lengkap.
2. Timbang dengan teliti EDTA sebanyak ± 10 gram.
3. Kemudian pindahkan ke dalam beaker glass, bilas cawan dengan sedikit aquadest.
4. Tamabahkan lagi sedikit aquadest, aduk larutan hingga homogen.
5. Pindahkan ke dalam labu ukur.
6. Kemudian impitkan dengan aquadest hingga mencapai tanda batas, dan kocok larutan hingga homogen.
7. Pindahkan larutan secara kuantitatif ke dalam botol reagen, berilah keterangan : nama larutan, tgl.pembuatan, dan pembuatnya.
8. Bersihkan semua alat – alat yang telah dipergunakan.

v Kesimpulan
Jadi, untuk membuat EDTA 10% dibutuhkan EDTA serbuk sebanyak 10 g.

E. Pembuatan Larutan Natrium Citrate 3,8 %
v Alat dan Bahan
ü Alat :
- Sendok tanduk
- Cawan porselen
- Gelas ukur
- Pipet tetes
- Beaker glass
- Batang pengaduk
- Corong
- Neraca
- Botol reagen
ü Bahan :
- Natrium citrate
- Aquadest

v Perhitungan
3,8 % =
Berat = 0,38 x 100 =  3.8 gram

v Prosedur Kerja
1. Siapkan alat dan bahan yang diperlukan dengan lengkap.
2. Timbang dengan teliti Natrium citrate sebanyak ± 3,8 gram.
3. Kemudian pindahkan ke dalam beaker glass, bilas cawan dengan sedikit aquadest.
4. Tambahkan lagi sedikit aquadest, aduk larutan hingga homogen.
5. Pindahkan ke dalam labu ukur.
6. Kemudian impitkan dengan aquadest hingga mencapai tanda batas, dan kocok larutan hingga homogen.
7. Pindahkan larutan secara kuantitatif ke dalam botol reagen, berilah keterangan : nama larutan, tgl.pembuatan, dan pembuatnya.
8. Bersihkan semua alat – alat yang telah dipergunakan.

v Kesimpulan
Jadi, untuk membuat Natrium citrat 3,8% sebanyak 100 ml dibutuhkan Natrium citrat padatan sebanyak 3,8 g.



Pewarnaan Tahan Asam ( Zeihl neelsen )


III. Tujuan Praktikum
1. Melihat morfologi dan sifat tahan asam dari bakteri
2. Untuk mencari BTA
IV. Dasar Teori
Salah satu bahan yang digunakan untuk mendiagnosa adalah dahak atau sputum. Dahak yang diperiksa paling sedikit 3-5 cc. Jika jumlah kuman kurang dari 5000 dalam 1 cc dahak, maka itu tidak akan kelihatan di bawah mikroskop.
Dahak yang diambil ialah dahak yang kental kuning kehijauan sebanyak 3-5 cc, dengan waktu pengambilan sebagai berikut :
§ Dahak sewaktu, penderita datang berobat dengan keluhan apa saja ke poliklinik.
§ Dahak pagi, yang diambil besok paginya begitu bangun tidur
§ Dahak sewaktu, yang diambil sewaktu penderita mengantar dahak pagi tersebut.
Ludah tidak dapat diperiksa karena ludah berasal dari kelenjar dalam rongga mulut. Biasanya dalam ludah tidak terdapat kuman TB.
Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol-fuchsin (fuchsin basayang dilarutkan dalam suatu campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam klorida dalam alkohol. Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram dengan cairan karbol fuchsin kemudian dipanaskan sampai keluar uap. Setelah itu, zat warna dicuci dengan asam alkohol dan akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau). Bakteri-bakteri tahan asam (spesies Mycobakterium dan beberapa Actinomycetes yang serumpun) berwarna merah dan yang lain-lain akan berwarna sesuai warna kontras.
Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang, yang tidak membentuk spora. Walaupun tidak mudah diwarnai bakteri ini tahan terhadap penghilangan warna (deklorisasi) oleh asam atau alkohol dan karena itu dinamakan basil tahan asam. Ciri –ciri khas Mycobakterium tuberculosis dalam jaringan, basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4 x 3 µm. Pada perbenihan buatan terlihat bentuk coccus dan filamen. Mycobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai gram positif atau gram negatif. Sekali diwarnai dengan zat warna basa, warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol, meski dibubuhi dengan iodium. Basil tuberkel yang sebenarnya ditandai oleh sifat tahan asam misalnya 95 % etil alkohol yang mengandung 3 % asam hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat akan menghilangkan warna semua bakteri kecuali Mycobakteria. Sifat tahan asam ini bergantung pada integritas struktur selubung berlilin. Pada dahak atau irisan jaringan, Mycobakteria dapat diperlihatkan karena memberi fluoresensi kuning jingga setelah diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya auramin, rodamin).
V. Alat dan Bahan
ü Alat
o Mikroskop
o Ose
o Lampu spritus
o Objek gelas
o Gelas sediaan
ü Bahan
o Sputum/dahak
o Carbol Fuchsin
o Alkohol 70%
o methylen blue 0,3%
o Minyak Immersi

VI. Metode Kerja :
1. Pakailah masker
2. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
3. Diambil kaca sediaan yang bersih, bebas lemak dan tidak ada goresan.
4. Disiapkan sebuah kaca sediaan yang diberi tanda ukuran 2X3 cm sebagai pola.
5. Diletakkan kaca pola dibawah kaca sediaan.
6. Lampu speritus dinyalakan dan ose dipanaskan sampai membara mulai ujung sampai kepangkal.
7. Dengan menggunakan ose steril lalu diambil bagian sputum yang kental berwarna putih kekuninggan atau putih kehijauan, lalu diletakkan pada kaca sediaan.
8. Sputum diratakan
9. Kemudian tangkai ose digoyangkan pelan-pelan untuk melepaskan sisa partikel sputum yang melekat pada ose.
10. Letakkan ose berdekatan pada api spiritus, setelah kering barulah dibakar sampai pijar.
11. Keringkan sediaan pada suhu kamar, jangan dikeringkan di atas nyala api. sediaan dilewatkan diatas nyala api lampu speritus sebanyak 3 X selama 3-5 detik.
12. Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan dengan apusan menghadap ke atas.
13. Tuangkan Carbol Fuchsin sampai menutupi seluruh permukaan kaca sediaan.
14. Panaskan kaca sediaan secara hati-hati dengan caara melewatkan nyala api pada bagian bawah kaca sehingga keluar uap(jangan sampai mendidih) selama 3 menit.
15. Sediaan dibiarkan hingga dinginn selama 5 menit.
16. Sediaan dicuci dengan air mengalir.
17. Tuangkan asam alkohol 70% di atas kaca sediaan sampai warna merah dari fuchsin hilang.
18. Sediaan dicuci dengann air mengalir
19. Tuangkan larutan methylen blue 0,3% diatas sediaan dan biarkan selama 10-20 detik atau larutan methylen blue 0,1% selama 1 menit.
20. Sediaan dicuci dengan air mengalir dan keringkan pada suhu kamar.
21. Sediaan yang sudah kering diperiksa dibawah mikroskop.
22. Teteskan satu tetes minyak emersi diatas sediaan, periksa dengan okuler 10X dan objektif 100X.
23. Carilah basil tahan asam (BTA) yang berwarna merah dengan latar belakang biru.
24. Periksa paling sedikit 100 lapangan pandang dengan cara menggeserkan sediaan dari kiri ke kanan atau dari kanan ke kiripada garis lurus.
25. Foto hasil pengamatan dan buatkan laporan

VII. Pembahasan
Pewarnaan Basil Tahan Asam (BTA) merupakan uji makroskopik yang memiliki nilai diagnosa yang tinggi karena pemeriksaan tersebut dapat memangkas isolasi bakteri yang akan memakan waktu sampai 8 minggu. Cara pengambilan spesimen harus di perhatikan, contohnya dalam pengambilan sampel darah atau dahak / sputum bukan hanya harus dilakukan secara aseptik untuk menghindari kontaminasi, namun juga harus diperhatikan waktu pengambilannya, karena infeksi bakteri memiliki siklus tertentu. Hati-hati dengan hasil false positive dan false negative. False positif maksudnya dalam sampel seharusnya tidak ditemukan bakteri namun dalam pelaporan / pengerjaan ditemukan bakteri. Hal ini bisa terjadi bila dalam pengerjaan terjadi kontaminasi. False negatif maksudnya dalam sampel seharusnya terdapat bakteri namun dalam pengerjaan / pelaporan tidak ditemukan bakteri. Hal ini bisa terjadi karena kurangnya ketelitian dalam penggunaan ose.
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen blue.
Pembacaan hasil dilakukan dengan menggunakan skala IUATLD sebagai berikut :
• Tidak ditemukan BTA dalam 100 lapangan pandang : Negatif
• Ditemukan 1-9 BTA/ 100 lapangan pandang : Ditulis jumlah kuman yang ditemukan.
• Ditemukan 10-99 BTA/ 100 lapangan pandang : + (1+)
• Ditemukan 1-10 BTA/ 1 lapangan pandang : ++ (2+)
Ditemukan > 10 BTA/ 1 lapangan pandang : +++ (3+)
VIII. Hasil Pengamatan


IX. Kesimpulan
Setelah dilakukan pewarnaan di laboratorium secara mikroskopik, dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen dapat dilakukan identifikasi bakteri tahan asam, dimana bakteri akan terbagi menjadi dua golongan:
j Bakteri tahan asam, adalah bakteri yang pada pengecatan Ziehl-Neelsen tetap mengikat warna pertama, tidak luntur oleh asam dan alkohol, sehingga tidak mampu mengikat warna kedua. Dibawah mikroskop tampak bakteri berwarna merah dengan warna dasar biru muda.
j Bakteri tidak tahan asam, adalah bakteri yang pada pewarnaan Ziehl-Neelsen, warna pertama, yang diberikan dilunturkan oleh asam dan alkohol, sehingga bakteri akan mengikat warna kedua. Dibawah miskroskop tampak bakteri berwarna biru tua dengan warna dasar biru yang lebih muda.
j Interpretasi hasil : BTA : warna merah dan Non BTA : warna biru























Ikterus adalah suatu sindroma yang dikarakteristikan oleh adanya hiperbilirubunemia dan deposit pigmen empedu pada jaringan termasuk kulit dan memberan mukosa (Kisaran normal pada anjing dewasa 0.1 – 0.6 mg/dl; kucing 0.12 – 0.3 mg/dl). Ikterus biasanya dapat dideteksi pada sclera, kulit, atau urin yang menjadi gelap bila bilirubin serum mencapai 2 – 3 mg/dl. Bilirubin serum normal adalah 0.3 – 1.0 mg/dl. Jaringan permukaan yang kaya elastin, seperti sclera dan permukaan baeah lidah, biasanya menjadi kuning pertama kali.

Pada individu normal, pembentukan dan eksresi bilirubin berlangsung melalui langkah-langkah seperti yang terlihat dalam gambar 2. Sekitar 80 – 85 % bilirubin terbentuk dari pemecahan eritrosit tua dalam system monosit-makrofag. Masa hidup rata-rata eritrosit adalah 120 hari. Setiap hari dihancurakan sekitar 50 ml darah, dan menghasilkan 250 sampai 350 mg bilirubin. Kini diketahui bahwa sekitar 15 – 20 % pigmen empedu total tidak bergantung pada mekanisme ini, tetapi berasal dari dekstruksi sel eritrosit matur dalam sumsum tulang (hematopoiesis tak efektif) dan dari hemoprotein lain, terutama dari hati.

Pada katabolisme hemoglobin (terutama terjadi dalam limpa), globin mula-mula dipisahkan dari heme, setelah itu heme diubah menjadi biliverdin. Bilirubin unconjugated (disebut dengan bilirubin bebas, bilirubun pre hepatic atau bilirubin reaksi tidak langsung) kemudian dibentuk dari biliverdin. Biliverdin adalah pigmen kehijauan yang dibentuk melalui oksidasi bilirubin. Bilirubin unconjugated larut dalam lemak, tidak larut dalam air, dan tidak dapat dieksresikan dalam empedu atau urine. Bilirubin unconjugated berikatan dengan albumin dalam suatu kompleks larut air, kemudian diangkut oleh darah ke sel-sel hati. Metabolisme bilirubin didalam hati berlangsung dalam tiga langkah : ambilan, konjugasi, dan eksresi. Ambilan oleh sel hati memerlukan dua protein hati, yaitu yang di beri symbol sebagai Y dan Z (lihat Gambar, 2 ) konjugasi bilirubin dengan asam glukoronat dikatalisasi oleh enzim glukoronil transferase dalam reticulum endoplasma. Bilirubin conjugated tidak larut dalam lemak, tetapi larut dalam air dan dapat dieksresikan dalam empedu dan urine.

Langkah terakhir dalam metabolisme bolirubin hati adalah traspor bilirubin unconjugated melalui memberan sel kedalam empedu melalui suatu proses aktif. Bilirubin unconjugated tidak dieksresikan kedalam empedu, kecuali setelah proses foto-oksidasi atau fotoisomerasi (lihat pembahasan berikut).

Bakteri usus mereduksi bilirubin conjugated menjadi serangkaian senyawa yang disebut sterkobilin atau urobilinogen. Zat-zat ini menyebabkan feses berwarna coklat. Sekitar 10 – 20 % urobilinogen mengalami siklus enterohepatik, sedangkan sejumlah kecil dieksresikan dalam urine.

Adanya peningkatan level bilirubin dalam plasma (hiperbilirubinemia) dapat terjadi akibat 6 gangguan utama :
1. Produksi bilirubin unconjugated yang berlebihan karena haemoglobin.
2. Gangguan up-take bilirubin unconjugated oleh sel hati yang tidak sempurna.
3. Konjugasi dari bilirubin unconjugated yang tidak sempurna oleh sel hati.
4. Eksresi bilirubin conjugated oleh sel hati yang tidak sempurna
5. Obstruksi aliran empedu dalam hati sering karena peradangan yang menyebabkan pembengkakan sel.
6. Obstruksi aliran empedu diluar hati karena adanya sumbatan atau tekanan pada duktus empedu
Ikterus/jaundice dapat terjadi akibat tidak sempurnanya level metabolisme bilirubin, produksi berlebihan, terganggunya penghantaran pada sel hati , tidak sempurna up take, gangguan konjugasi, tidak sempurnanya eksresi kedalam canalikuli atau obstruksi drainase pada duodenum.

Ikterus/jaundice pada dasarnya diklasifikasikan sebagai hemolitik, hepatoseluler atau obstruksi (cholestasis), walaupun kadang terjadi tumpang tindih terutama antara tipe hepatoseluler dan obstuksi. Test yang sering digunakan untuk mengukur level bilirubin adalah reaksi Van Den Berg yang menggunakan suatu larutan beralkohol pada test bilirubin total (conjugated, unconjugated) dan yang menggunakan larutan berair hanya untuk mengukur bilirubin conjugated. Selisih antara keduanya merupakan level bilirubin unconjugated.

Penyebab peningkatan level bilirubin plasma (hiperbilirubinemia) :
1. Bilirubin unconjugated dapat terjadi pada :
a. Haemolysis akut parah
b. Penyerapan haematom besar atau haemoragi internal sangat besar
c. Transfusi RBC yang disimpan
Haemolysis akut parah dapat terjadi karena pelepasan sejumlah besar Hb yang cepat kedalam plasma yang merupakan gambaran dari haemolysis intravaskular. Sejumlah besar bilirubin (unconjugated) dibentuk secara besar-besaran melebihi kapasitas hati untuk konjugasinya. Peningkatan bilirubin unconjugated plasma dapat sebagai akibat peningkatan produksi pigment (haemolisin atau erytropoiesis tidak efektif) atau gangguan up take hati atau konjugasi dari bilirubin. Pada ikterus haemolitik hiperbilirubinemia awlnya secara karakteristik ditandai oleh jumlah besar bilirubin unconjugated. 3 – 4 hari setelah kerisis haemolitik, konsentrasi bilirubin conjugated pada plasma dapat sama atau lebih tinggi dari pada bilirubin unconjugated ( total bilirubin dapat tetap tinggi walaupun kurang dibandingkan selama krisis haemolitik). Hal ini dapat terjadi karena konjugasi telah berlangsung tetapi kapasitas sel hati untuk eksresi bilirubin conjugated melebihi dan/ atau sel hati rusak disebabkan karena kekurangan RBC. Oleh karena itu pada stadium tertentu dari ikterus haemolitik, konsentrasi relatif dari bilirubin unconjugated dan conjugated dapat tumpang tindih dengan yang diamati pada penyakit hepatoseluler dan obstruksi empedu.

Diduga peningkatan bilirubin conjugated pada ikterus haemolitik lanjut disebabkan oleh karena sistem eksresi hati yang sebelumnya normal, oleh adanya anemic anoksia sehingga up take dan eksresi bilirubin hepatoseluler secara relatif tetap normal, kurangnya eksresi dapat menyebabkan regurgitasi dari hepatisit kedalam darah. Kemungkinan produksi bilirubin conjugated yang berlebih dalam hepatoseluler karena adanya penebalan empedu sehingga mengakibatkan destruksi empedu intrahepatik dan regurgitasi dari bilirubin conjugated kedalam darah.

Jika hemolisis terjadi secaraa intavaskular dan cukup cepat, plasma dapat merah karena adanya peningkatan jumlah Hb bebas. Secara normal protein plasma mengikat 3 Hb sirkulasi yang bebas dan mencegah masuk ke urine dengan cepat, haemolisis besar-besaran dan semua plasma protein dapat jenuh dengan Hb. Haemoglobin yang tidak diikat akan difiltrasi oleh glomerulus dan muncul dalam urine sehingga urine tampak merah. Anemic anoxia dapat menyebabkan jerusakan memberan hepatoseluler dan meningkatkan akktivitas ALT dalam serum. Diduga obstuksi empedu disebabkan adanya penebalan empedu yang menyebabkanpeningkatan alkalin pospatase (AP) dalam serum.

Beberapa kejadian dari hemolisis intravaskuler yang terjadi secara primer:
• Kasus tertentu dari anemia haemolitik autoimun.
• DIC dan torsio splenik.
• Tipe tertentu dari keracunan, mis: obat oksidan atau venom ular.
• Lisis fisik – penyuntikan iv larutan hipotonis (tertama air), panas mis: kebakaran paarah dan radiasi.
• Transfusi darah yang tidak cocok.
• Haemobartonelosis.
• Babesiosis (Menyebabkan ikterus praehepatik, karena dapat menyebabkan hemolisis sehingga dapat terjadi hiperbilirubinemia)

`Penyerapan haematom besar atau menyertai haemoragi internal sangat hebat. Penyebab perdarahan usus seperti ini kemungkinan keracunan oleh rodenticida anti coagulan. Makrofag jaringan memfagosit RBC dan menurunkan Hb menjadi bilirubin unconjugated yang kemudian dirubah dalam hati. Ikterus terutama terjadi pada hewan yang sangat muda. Baik haemolosis parah maupun haemoragi besar-besaran dapat mengakibatkan anemia regeneratif, mis: PCV rendah dan reticulositosis.

Transfusi RBC yang disimpan , hiperbilirubinemia terjadi jika darah dikoleksi lebih dari 3 minggu sebelun ditangani, RBC tua ini secara cepat dipisahkan dan dibentuk sejuimlah besar bilirubin unconjugated.

2. Bilirubin unconjugated dan bilirubin conjugated hampir sama dapat terjadi pada :
a. Hilangnya fungsi hepatoseluler setelah hati rusak, pada umumnya ini dapat terjadi karena kelainan hati kronis atau kerusakan ringan (mis, hepatitis active chronis) antara 20% dan 60% dari bilirubin conjugated.
b. Obstruksi saluran empedu, biasanya intrahepatik (hiperbilirubinemia regurgitasi) dengan obstruksi dari bilirubin. Pada umumnya bilirubin conjugated lebih dominan.
c. Setelah hemolisis akut parah (hematom besar atau hemoragi internal sangat besar). Jika level bilirubin conjugated tinggi, penyebab dari hemolisis tersebut seperti pada hemolisis akut parah biasanya bilirubin conjugated kurang dari 50% total.

Penykit hepatoseluler dan obstruksi saluran empedu (intrahepatik dan post hepatik) dapat mengakibatkan peningkatan bilirubin conjugated dan unconjugated dalam plasma dengan level bilirubin conjugated yang lebih menonjol sebelumnya. Pada ikterus hepatik dimana kerusakan terjadi dalam hati itu sendiri, peradangan mengakibatkan fungsi sel terganggu sehingga hati tidak dapat mengambil bilirubin bebes secepat biasanya. Selain itu kerusakan sel hati yang membengkak akan menekan termasuk canaliculi kecil yang membewa empedu dari sel hati ke ductus empedu. Bilirubin conjugated yang tidak dapat meninggalkan sel hati melalui rute normal akan masuk sinusoid darah dan berakhir pada sirkulasi umum. Sehingga baik bilirubin conjugated maupun unconjugated muncul dalam sirkulasi, level urobilinogen dan bilirubin muncul dalam urine.

3. Sebagian besar bilirubin conjugated.
a. Hilangnya fungsi hepatoseluler (umum), biasanya dapat terjadi karena toxic pada keracunan atau obat ( fosfor, senyawa fenolik, alfatoksin, parakuat, thalium, paracetakol/acetaminopen terutama pada kucing, dan larutan organik, mis chloroform dan CCl4).
Banyak dari obat lain yang dapat menyebabkan kerusakan hati dengan kebocoran enzim dan /atau fungsi hati tetapi tanpa hiperbilirubinemia yang nyata.
b. Penyakit infeksius: infeksi primer penting adalah Canin adenovirus-1, Leptospira dan hiperbilirubinemia yang berhubungan dengan peradangan akut.
• Infeksius canine hepatitis (infeksi adenovirus-1 sistemik pada anjing), hiperbilirubinemia, ikterus dan bilirubinuria kurang umum dari yang diharapkan akibat nekrosa centrolobuler kurang mencampuri dengan pengaliran empedu dari pada nekrosis perifer, namun 35% kasus parah memperlihatkan ikterus.
• Leptosrirosis menyebabkan ikterus prehepatik dan hepatik karena leptospira dapat menyebabkan hemolisis yang ekstraseluler dan intraseluler selain itu leptospira menyerang hepatosit yang mengakibatkan fungsi hati terganggu sehingga terjadi hiperbilirubinemia dan juga menyebabkan pengaktifitas enzim pada hati.
c. Parasit. Cacing hati dapat menyebabkan obstruksi empedu dan hepatitis pada kucing.

Empat mekanisme umum yang menyebabkan hiperbilirubinemia dan ikterus:
1.
Pembentukan bilirubin yang berlebihan
Penyakit hemolitik atau peningkatan laju dekstrusi eritrosit merupakan penyebab tersering dari pembentukan bilirubin yang berlebihan. Ikterus yang timbul sering disebut sebagai ikterus hemolitik. Konjugasi dan transfer pigmen berlangsung normal, tetapi suplai bilirubin tak terkonjugasi melampaui kemampuan hati. Hal ini mengakibatkan peningkatan kadar bilirubintak terkonjugasi dalam darah. Bilirubin tek terkonjugasi tidak larut dalam air, sehinggatidak dapat dieksresikan dalam urine dan tidak terjadi bilirubinuria. Namum demikian terjadi peningkatan pembentukan urobilinogen, yang selanjutnya meningkatkan ekskresi dalam feses dan urine. Urine dan feses bewarna gelap.
2. Gangguan pengambilan bilirubin tak terkonjugasi oleh hati
Ambilan bilirubin tak terkonjugasi terikat albumin oleh sel hati dilakukan dengan memisahkan dan mengikatkan bilirubin tehadap protein penerima.
3. Gangguan konjugasi bilirubin
Hiperbilirubinemia tak terkonjugasi ringan (<12,9 mg/100 ml) yang timbul antara hari kedua dan kelina setelah lahir disebut sebagai ikterus fisiologis neonatus. Ikterus neonatal yang normal ini disebabkan oleh imaturitas enzim glukoronil tranferase. Aktifitas enzim glukonil trasferase biasanya meningkat beberapa hari hingga minggu kedua setelah lahir, dan setelah itu ikterus akan menghilang.
4. Penurunan eksresi bilirubin terkonjugasi terutama dalam empedu akibat faktor intrahepatik dan ekstrahepatik yang bersifat fungsional atau yang disebabkan oleh obstruksi mekanis.

Bilirubin terkonjugasi larut dalam air, sehingga dapat dieksresikan dalam urine dan menimbulkan bilirubinuria serta urine yang gelap. Urobilinogen feses dan urobilinogen urine sering menurun sehingga feses trlihat pucat. Peningkatan kadar bilirubin terkonjugasi dapat disertai bukti-bukti kegagalan fungsi hati lainnya, seperti peningkatan kadar fospatase alkali, AST, kolesterol dan garam empedudalam serum. Kadar garam empedu yang meningkat dalam darah menimbulkan gatal-gatal pada ikterus. Ikterus akibat hiperbilirubinemia terkonjugasi bisanya lebih kuning dibandingkan akibat hiperbilirubinemia tak terkonjugasi

Hiperbilirubinemia adalah keadaan dimana konsentrasi bilirubin darah melebihi 1mg/dl. Pada konsentrasi lebih dari 2 mg/dl, hiperbilirubinemia akan menyebabkan gejala ikterus atau jaundice. Ikterus atau jaundice adalah keadaan dimana jaringan terutama kulit dan sklera mata menjadi kuning akibat deposisi bilirubin yang berdiffusi dari konsentrasinya yang tinggi didalam darah. Hiperbilirubinemia dikelompokkan dalam dua bentuk berdasarkan penyebabnya yaitu hiperbilirubinemia retensi yang disebabkan oleh produksi yang berlebih dan hiperbilirubinemia regurgitasi yang disebabkan refluks bilirubin kedalam darah karena adanya obstruksi bilier. Hiperbilirubinemia retensi dapat terjadi pada kasus-kasus haemolisis berat dan gangguan konjugasi. Hati mempunyai kapasitas mengkonjugasikan dan mengekskresikan lebih dari 3000 mg bilirubin perharinya sedangkan produksi normal bilirubin hanya 300 mg perhari.

Hal ini menunjukkan kapasitas hati yang sangat besar dimana bila pemecahan heme meningkat, hati masih akan mampu meningkatkan konjugasi dan ekskresi bilirubin larut. Akan tetapi lisisnya eritrosit secara massive misalnya pada kasus sickle cell anemia ataupun malaria akan menyebabkan produksi bilirubin lebih cepat dari kemampuan hati mengkonjugasinya sehingga akan terdapat peningkatan bilirubin tak larut didalam darah. Peninggian kadar bilirubin tak larut dalam darah tidak terdeteksi didalam urine sehingga disebut juga dengan ikterus acholuria. Pada neonatus terutama yang lahir premature peningkatan bilirubin tak larut terjadi biasanya fisiologis dan sementara, dikarenakan haemolisis cepat dalam proses penggantian hemoglobin fetal ke hemoglobin dewasa dan juga oleh karena hepar belum matur, dimana aktivitas glukoronosiltransferase masih rendah. Apabila peningkatan bilirubin tak larut ini melampaui kemampuan albumin mengikat kuat, bilirubin akan berdiffusi ke basal ganglia pada otak dan menyebabkan ensephalopaty toksik yang disebut sebagai kern ikterus . Beberapa kelainan penyebab hiperbilirubinemia retensi diantaranya seperti Syndroma Crigler Najjar I yang merupakan gangguan konjugasi karena glukoronil transferase tidak aktif, diturunkan secara autosomal resesif, merupakan kasus yang jarang, dimana didapati konsentrasi bilirubin mencapai lebih dari 20 mg/dl. Syndroma Crigler Najjar II, merupakan kasus yang lebih ringan dari tipe I, karena kerusakan pada isoform glukoronil transferase II, didapati bilirubin monoglukoronida terdapat dalam getah empedu. Syndroma Gilbert, terjadi karena haemolisis bersama dengan penurunan uptake bilirubin oleh hepatosit dan penurunan aktivitas enzym konjugasi dan diturunkan secara autosomal dominan. Hiperbilirubinemia regurgitasi paling sering terjadi karena terdapatnya obstruksi pada saluran empedu, misalnya karena tumor, batu, proses peradangan dan sikatrik. Sumbatan pada duktus hepatikus dan duktus koledokus akan menghalangi masuknya bilirubin keusus dan peninggian konsentrasinya pada hati menyebabkan refluks bilirubin larut ke vena hepatika dan pembuluh limfe. Bentuknya yang larut menyebabkan bilirubin ini dapat terdeteksi dalam urine dan disebut sebagai ikterus choluria. Karena terjadinya akibat sumbatan pada saluran empedu disebut juga sebagai ikterus kolestatik. Bilirubin terkonjugasi dapat terikat secara kovalen pada albumin dan membentuk ? bilirubin yang memiliki waktu paruh

Beberapa kelainan lain yang menyebabkan hiperbilirubinemia regurgitasi adalah Syndroma Dubin Johnson, diturunkan secara autosomal resesif, terjadi karena adanya defek pada sekresi bilirubin terkonjugasi dan estrogen ke sistem empedu yang penyebab pastinya belum diketahui. Syndroma Rotor, terjadi karena adanya defek pada transport anion an organik termasuk bilirubin, dengan gambaran histologi hati normal, penyebab pastinya juga belum dapat diketahui. Hiperbilirubinemia toksik adalah gangguan fungsi hati karena toksin seperti chloroform, arsfenamin, asetaminofen, carbon tetrachlorida, virus, jamur dan juga akibat cirhosis. Kelainan ini sering terjadi bersama dengan terdapatnya obstruksi. Gangguan konjugasi muncul besama dengan gangguan ekskresi bilirubin dan menyebabkan peningkatan kedua jenis bilirubin baik yang larut maupun yang tidak larut. Terapi phenobarbital dapat menginduksi proses konjugasi dan ekskresi bilirubin dan menjadi preparat yang menolong pada kasus ikterik neonatus tapi tidak pada sindroma Crigler najjar. Phototerapi dengan cahaya dapat merubah bilirubin menjadi lebih polar dan merubahnya menjadi beberapa isomer yang larut dalam air meskipun tampa konjugasi dengan asam glukoronida sehingga dapat diekskresikan keempedu. Kasus obstruksi umumnya ditangani dengan tindakan bedah. mikroskopik akan nampak adanya cairan bening berupa gelatin yang menggantikan posisi depo lemak tubuh.



























Pembiakan dan identifikasi bakteri bersumber dari spesimen yang merupakan hasil proses infeksi, sedangkan infeksi itu sendiri dapat berasal dari berbagai sumber,beberapa tahapan terjadinya proses infeksi :
§ Infeksi memerlukan tempat masuk yang sesuai (port of entry) misalnya saluran pernafasan, saluran pencernaan, kontak langsung, gigitan serangga.
§ Tempat masuknya bakteri biasanya spesifik terutama untuk bakteri patogen, bakteri harus tumbuh dan berkembang dalam tubuh hospes dan menyebar melalui  system limfa dan aliran darah menyebar ke seluruh jaringan,
§ Penyebaran infeksi memerlukan jalan keluar unuk menginfeksi hospes lainnya (port of exit). .
Istilah mikroorganisme yang biasanya merupakan penyebab penyakit disebut patogen dan patogenitas adalah kemampuan mikroorganisme menyebabkan sakit. Virulensi berhubungan dengan derajat patogenitas bakteri. Patogenitas dan virulensi berkaitan dengan penyebaran atau toksigenitas. Penyebaran artinya kemampuan bakteri untuk masuk untuk masuk , menyebar dam berkembangbiak di dalam jaringan hospes. Toksigenitas berhubungan dengan kemampuan bakteri menghasilkan toksin. Virulensi dinyatakan dengan LD50 yaitu konsentrasi mikroorganisme yang menyebabkan 50 persen hewan percobaan sakit. Proses ketika mikroorganisme patogen masuk dikenal dengan infeksi, selama proses ini hospes dapat menjadi sakit, infeksi terselubung atau sehat menjadi carrier
Aspek patogenitas bakteri
Patogenitas bakteri terutama disebabkan oleh adanya kapsul pada bakteri tersebut, bakteri yang tidak berkapsul lebih mudah untuk difagosit oleh sel leukosit. Hilangnya kapsul bakteri berhubungan dengan hilangnya virulensi bakteri karena kapsul diketahui sebagai faktor pengganggu. (contohnya bakteri pneumococcus)
Toksin bakteri
Toksin bakteri diketahui memiliki peranan penting dalam kemampuan bakteri menimbulkan penyakit. Toksin dibagi dalam kelompok eksotoksin dan endotoksin.
a.   Eksotoksin
Eksotoksin di hasilkan oleh bakteri ke lingkungan dan potensial serta spesifik untuk jaringan hospes, kemampuan menghasilkan eksotoksin biasanya pada bakteri gram positif batang seperti Clostridium dan Corynebacterium. Eksotoksin merupakan antigen kuat, tidak tahan panas, merupakan substansi protein, hancur oleh enzim proteolitik kecuali Clostridium botulinum, efek toksin dapat hancur oleh formalin, panas dan penyimpanan yang lama tetapi tidak untuk sifat antigeniknya, contohnya toxoid untuk program imunisasi
b.   Endotoksin.
Endotoksin ditemukan intraseluler, terdapat pada dinding sel bakteri dan toksin ini dilepaskan oleh bakteri setelah bakteri hancur, endotoksin biasanya berhubungan dengan bakteri gram negatif dan bersifat antigen lemah. Endotoksin bersifat tahan terhadap panas, polisakaridanya tidak dapat dicerna oleh enzim proteolitik, endotoksin bersifat toksin lemah dan menginduksi reaksi demam pada hospes dan dapat menyebabkan syok
Enzim ekstraseluler
Beberapa mikroorganisme memproduksi enzim ekstraseluler yang ikut berperan dalam patogenitas, enzim tersebut adalah:
a. Enzim koagulase, berhubungan dengan patogenitas Staphylococcus. Uji koagulase dilakukan menggunakan plasma menyebabkan terjadinya koagulasi.
b. Kolagenase adalah enzim yang dibentuk oleh Clostridium, bersifat dapat menghancurkan kolagen sehingga menyebabkan bakteri menyebar ke jaringan
c. Hialuronidase adalah enzim yang diketahui sebagai faktor penyebaran bakteri. Enzim ini diproduksi oleh Staphylococcus, Clostridium, Streptococcus dan Pneumococcus.
d. Streptokinase dikenal pula sebagai enzim fibrinolisin, diproduksi oleh Streptococcus, Staphylococcus, dan Clostridium perfringens. Streptokinase merupakan enzim proteolitik plasma yang disebut plasmin, plasmin dapat melarutkan plasma yang terkoagulasi dan aktifitas tersebut memungkinkan bakteri menyebar
e. Hemolisin merupakan kelompok substansi terlarut yang diproduksi oleh Staphylococcus, Pneumococcus, beberapa Clostridium, dan Steptococcus, hemolisin bersifat merusak jaringan. Streptolisin memiliki kemampuan melisiskan eritrosit.
f. Leukosidin dalah substansi yang merusak leukosit, mereka diproduksi oleh streptococcus dan staphylococcus
Bakteri berdasarkan kebutuhan energi, dibagi dalam dua kelompok, yaitu
Ø Bakteri autotrof
Bakteri autotrof memperoleh energi dan tumbuh pada anorganik media, membutuhkan karbondioksida sebagai sumber karbon
Ø   Bakteri heterotrof
Bakteri heterotrof mendapatkan energi dari sumber karbon organik.Bakteri heterotrof membutuhkan penambahan gula, asam amino, purin, pirimidin dan vitamin pada media kultur. Fermentasi gula merupakan sumber energi utama

Morfologi bakteri
Ukuran bakteri coccus berdiameter 1 micron (μ), bakteri batang memiliki lebar 0.5 μ dan panjang of 2 μ, sedangkan spirochaeta berbentuk ulir dengan lebar 0.2 μ dan lebar 10 μ.
Bentuk-bentuk bakteri:
Struktur bakteri
Struktur umum bakteri terdiri dari
Ø   Dinding sel
Ø   Membrane sitoplasma
Ø   Sitoplasma
Ø   Inti
Struktur khusus bakteri:
Ø   Kapsul, merupakan substansi eksretori, sebagai benteng pertahanan melawan fagositosis oleh sel darah putih dan penetrasi virus
Ø   Flagel , berasal dari protein elastin yang berada di sitoplasma dan keluar badan bakteri berfungsi sebagai organ pergerakan
Ø   Spora, bentuk vegetatif bakteri untuk bertahan pada lingkungan yang kurang menguntungkan
Ø   Inclusion bodies, vakuola yang berfungsi sebagai tempat sisa material di sitoplasma
Metode mikroskopis adalah merupakan upaya mendapatkan informasi sementara terhadap bakteri penyebab infeksi, akan tetapi pembiakan biasanya diperlukan untuk identifikasi secara pasti dan mengenal sifat bakteri.Tujuan dari pembiakan bakteri adalah terdiri dari tiga tujuan utama yaitu:
1) Untuk menumbuhkan dan mengisolasi seluruh bakteri yang ada dalam spesimen
2) Untuk penentuan jenis bakteri mana yang pertumbuhannya paling menyerupai bakteri penyebab infeksi dan bakteri mana yang sepertinya merupakan kontaminan
3) Untuk mendapatkan pertumbuhan bakteri yang cukup terhadap bakteri yang sesuai secara klinik sehingga dapat diidentifikasi sesuai sifat pertumbuhannya

Media perbenihan
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya sesuai kebutuhan bakteri. Oleh karena bakteri yang berbeda memerlukan kebutuhan akan nutrisi yang berbeda pula , sehingga dikembangkan berbagai macam media pertumbuhan untuk digunakan dalam diagnosa mikrobiologi.
Media perbenihan terdiri dari dua bentuk yaitu bentuk cair dan padat (agar). Pada media cair, bahan-bahan gizi dilarutkan dalam air sehingga pertumbuhan bakteri ditandai dengan perubahan warna madia menjadi keruh, semakin banyak bakteri tumbuh akan semakin keruh larutan. Diperlukan jumlah bakteri 106 sehingga dapat terlihat adanya pertumbuhan tanpa mikroskop. Media padat dibuat dengan penambahan bahan pengeras pada campuran bahan gizi dan air. Biasanya digunakan agarosa yang memiliki sifat cair pada suhu ≥ 95C tetapi berbentuk padat pada suhu dibawah 50C. Dengan kondisi inkubasi yang sesuai bakteri dapat tumbuh dan berkembang dalam jumlah yang banyak sehingga dapat dilihat tanpa menggunakan mikroskop. Pertumbuhan bakteri membentuk kelompok yang terdiri dari satu jenis bakteri yang disebut koloni, dengan kata lain dalam satu koloni adalah bakteri yang sama genus dan spesiesnya memiliki karakteristik gen dan fenotip yang sama. Pembiakan bakteri yang terdiri dari satu macam koloni yang seragam disebut dengan pembiakan murni. Pembiakan yang murni diperlukan untuk identifikasi bakteri, untuk memudahkan pengambilan koloni yang sama ketika ditanam pada media identifikasi
Bahan-bahan media pertumbuhan
1. Bahan dasar
a.   Air (H2O) sebagai pelarut
b.   Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45C.
c.   Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
d.   Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat.
2. Nutrisi atau zat makanan
a. Nikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea. Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg
b. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.
c. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain dan sejumlah vitamin.
3. Bahan tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan.
4. Bahan lain yang sering digunakan dalam pembuatan media
a. Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.
b. Meat extract. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak,limpa, plasenta dan daging sapi.
c.   Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (Bcomplex).
d. Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunakan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll.Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.

Klasifikasi dan fungsi media:
1. Medium berdasarkan sifat fisik
Ø   Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelahdingin media menjadi padat..
Ø   Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semisolid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
Ø   Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth),TSB (Trypticase Soy Broth)

2. Medium berdasarkan komposisi
Ø Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
Ø Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak
dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
Ø Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahandasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.

3. Medium berdasarkan tujuan
Ø Media untuk isolasi
Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
Ø Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Saltbroth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.
Ø Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, buffer charcoal yeast extract agar yang mengandung L-cystein dan bahan gizi lain untuk pertumbuhan legionella pneumophila penyebab penyakit legionnair.
Ø Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakanuntuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
Ø Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth,Arginine Agar.
Ø   Media diferensial
Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari bakteri lainnya yang sama-sama tumbuh dalam media perbenihanberdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial,misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni, media Mac conkey agar merupakan media diferensial dan slektif karena tidak dapat menumbuhkan bakteri gram positif.
Dari sekian banyak macam media, media yang paling sering digunakan untuk identifikasi bakteri adalah :
1. Brain-Heart infusion (BHI) / perbenihan cair.
BHI adalah media penyubur yang berguna untuk pertumbuhan berbagai macam bakteri baik bentuk cair maupun agar. Bahan utama terdiri dari beberapa jaringan hewan ditambah pepton, buffer posfat, dan sedikit dekstrosa. Penambahan karbohidrat memungkinkan bakteri dapat menggunakan langsung sebagai sumber energi. BHI biasanya digunakan untuk media pertumbuhan spesimen darah
2. Perbenihan cair Gram negative (GN broth).
Media selektif gram negatif digunakan untuk pembiakan bakteri patogen saluran pencernaan ( salmonella spp dan shigella spp) dari spesimen faeces dan rectal swab. Larutan berisi beberapa bahan aktif termasuk natrium sitrat dan natrium deoksikolat yang menghambat pertumbuhan organisme gram positif dan mempercepat pertumbuhan bakteri gram negatif. Untuk mengoptimalkan selektfitas media, GN broth setelah diinkubasi 6-8 jam setelah penanaman pertama harus diisolasi ulang dan diinkubasikan kembali, apabila melewati waktu tersebut bakteri nonenterik patogen akan tumbuh melampaui pathogen
3. Columbia CNA mengandung darah
Agar Columbia CAN adalah media dasar yang mengandung tiga komponen sumber pepton dan darah domba 5% yang tidak mengandung fibrin. Media ini juga dapat membedakan reaksi bakteri berdasarkan kemampuan dalam menghemolisa darah. CNA adalah merupakan antibiotic Colistin (C) dan Nalidixic acid (NA) yang ditambahkan ke dalam media untuk menghambat mikroorganisme gram negatif dan menumbuhkan bakteri gram positif. Contohnya untuk perbenihan Lactobacillus spp dari specimen secret vagina, streptococcus yang menyebabkan infeksi pada vagina dan wanita hamil.
4. Hektoen Enteric agar (HE)
Terdiri dari garam empedu dan zat warna indikator (brom thymol blue dan fuchsin acid) untuk memperlambat bakteri non patogenik gram negatif batang yang terdapat di saluran pencernaan dan memberi kesempatan salmonella dan shigella tumbuh. Media HE juga merupakan media differensial karena bakteri non enterik patogen akan tumbuh koloni berwarna oranye sampai merah muda kekuningan. Koloni ini timbul dari organisme yng memiliki kemampuan menfermentasi laktosa dalam media, kemampuan meragi menghasilkan asam yang akan menurunkan pH media dan meyebabkan perubahan indikator bromthymol blue. Shigella tidak meragi laktosa sehingga sehingga warna media biru kehijauan tidak berubah seperti karakteristik media diferensial, media mengandung feri ammonium sitrat yang mendeteksi adanya produksi gas H2S seperti salmonella spp. Dapat terlihat melalui adanya presipitasi warna hitam pada media.
5. Mac conkey agar
Mac conkey agar adalah media selektif dan differensial yang paling sering digunakan. Media ini terdiri dari zat warna Kristal violet untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan jamur dan memungkinkan beberapa macam bakteri gram negatif batang tumbuh , netral red sebagai pH indikator memberikan warna pink sampai merah pada koloni misalnya salmonella spp. Untuk bakteri yang tidak meragikan laktosa misalnya shigella spp memberikan warna koloni jernih transparan
6. Phenyl ethyl alcohol (PEA)
PEA adalah agar darah domba yang ditambahkan phenyl etil alcohol untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif darah domba 5% dalam PEA menyediakan kebutuhan nutrisi untuk bakteri gram positif coccus seperti enterococcus, streptococcus dan staphylococcus
7. Perbenihan cair tioglikolat
Perbenihan cair tioglikolat adalah media penyubur, yang mengandung bahan-bahan nutrisi seperti casein, ragi dan ekstrak daging sapi serta vitamin untuk mempercepat pertumbuhan , bahan lain yang ditambahkan indikator oksidasi-reduksi (resazurin), dextrose, vitamin K1 dan hemin biasa ditambahkan pada media modifikasi thayer martin sebagai tambahan pada media ditambahkan 0,075% untuk mencegah pengaruh oksigen langsung terhadap larutan , bahan tambahan ini diberikan untuk memberikan suasasana anaerob pada bagian dasar tabung sehingga bakteri anaerob dapat tumbuh
8. Agar darah
Agar darah merupakan media yang paling banyak digunakan unuk penanaman bakteri yang sukar tumbuh karena pada agar darah domba mengandung nutrisi yang dibutuhkan bakteri. Kemudian pula koloni yang tumbuh pada media ini biasanya spesifik dan mudah dikenali. Media pada dasarnya terdiri dari sumber protein(pepton), protein kedelai olahan (mengandung KH),NaCl, agar dan darah domba 5%. Bakteri penghasil enzim ekstraseluler yang dapat melisiskan sel darah merah domba pada agar (hemolisis). Aktifitas ini ditandai dengan adanya zona jernih disekeliling koloni (beta hemilisis), kehijauan (alpha hemolisis) dan untuk bakteri yang tidak menghemolisa darah tidak terjadi perubahan pada sekeliling koloni bakteri ( gamma /non hemolisis)
9. Agar coklat dan Thayer martin
Agar coklat sama seperti agar darah tetapi pada agar coklat darah yang digunakan di lisiskan terlebih dahulu sebelum dimasukan ke larutan agar. Setelah darah lisis sel eritrosit mengeluarkan bahan-bahan intraseluler seperti haemoglobin, hemin,dan koenzim nicotinamide adenine dinucleotida (NAD) yang dapat digunakan oleh bakteri yang sukar tumbuh. Darah yang lisis memberikan warna coklat pada media sehingga disebut dengan agar coklat. Biasanya bakteri patogen yang tumbuh pada media agar coklat yaitu: Neisseria meningitidis ,Haemophilus spp (terlibat dalam infeksi saluran pernafasan dan telinga)
Agar Thayer martin
Thayer martin agar adalah media diperkaya dan selektif untuk isolasi Neisseria gonorhoeae. Penambahan antibiotik colistin bertujuan untuk menghambat bakteri gram negatif, vancomisin untuk menghambat bakteri gram positif dan nistatin menghambat pertumbuhan ragi. Antibiotik trimetropin jugsa ditambahkan untuk menghambat perumbuhan Proteus spp, dan bakteri lainnya yang akan tumbuh menyebar di seluruh permukaan agar dan dapat meghalangi koloni bakteri yang akan diidentifiasi Neisseria spp. pada mredia modifkasi Thayer martin lewis, antibiotik nistatin diganti dengan ansamisin
Gambar 3. Perumbuhan pada agar coklat dan thioglykolat


Sterilisasi media
Bahan media yang telah dilarutkan , baik media cair maupun untuk meda pdat harus dilakukan terlebih dahulu melalui proses sterilisasi menggunakan Autoclave yaitu alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121C (250F). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan selama 15 menit. dan waktu harus dihitung dimulai ketika suhu telah mencapai 121 C . Setelah di autoclave media harus mencapai suhu sekurangnya 50 C sebelum dituang ke dalam cawan petri steril (biasanya 25 ml untuk satu cawan petri) sedangkan untuk penambahan bahan-bahan seperti darah, antibiotik, vitamin dan mineral harus ditambahkan pada saat agar dingin sebelum dituang ke cawan petri. Untuk komponen media yang tidak tahan panas dapat dilakukan sterilisasi dengan cara filtrasi membran
Lingkungan yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba
Kondisi lingkungan yang optimal akan mendukung pertumbuhan bakteri pada media pembiakan, empat faktor lingkuangan yang paling penting, yaitu:
a) Tersedianya oksigen atau karbondioksida
Kebanyakan bakteri klinik adalah terdiri dari bakteri aerob, anaerob fakultatif atau anaerob obligat. Bakteri aerob adalah bakteri yang menggunakan oksigen sebagai reseptor elektron. Bakteri anaerob fakultatif dapat tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob. Tetapi untuk bakteri seperti Pseudomonas spp, Neisseria spp, Bordetela spp, Brucella spp dan Francisella spp adalah bakteri obligat aerob yaitu bakteri yang tidak dapat tumbuh tanpa ada oksigen. Sedangkan bakteri yang membutuhkan oksigen dalam jumlah sedikit disebut bakteri mikroaerofilik
b) Suhu
Bakteri pathogen biasanya tumbuh sangat baik pada suhu yang sama dengan suhu jaringan dan organ tubuh hospes yaitu 37C walaupun demikian suhu pembiakan biasanya berada pada rentang 35-37C. akan tetapi beberapa bakteri memerlukan suhu tertentu untuk inkubasinya mislnya: campylobacter jejuni (42 C), listeria monocytogenes dan yersinia enterocolitica (dapat tumbuh pada suhu 0 C tapi suhu optimum antara 20 dan 40 C
c) pH
pH adalah pengukuran konsentrasi ion hydrogen pada lingkungan mikroorganisme.nilai pH 7 menunjukkan kondisi netral, sedangkan pH lebih kecil dari 7 disebut asam dan lebih besar dari 7 disebut basa. Kebanyakan bakteri klinik menyukai kondisi pH diantara pH netral sekitar 6,7-7,5, kebanyakan media yang diperjualbelikan telah mengandung buffer sehingga pengecekan ph sudah tidak diperlukan lagi
d) Kelembaban
Air merupakan komponen yang sudah terdapat dalam media, baik pada media padat ataupun cair tapi untuk penyimpanan dalam jangka waktu yang lama saat pembiakan bakteri akan menyebabkan kehilangan sebagian besar kadar air yang timbul karena proses evaporasi. Kehilangan air dari media dapat mengganggu petumbuhan bakteri melalui dua cara yaitu:
o berkurangnya air yang merupakan komponen penting yang akan digunakan untuk metabolisme bakteri
o dengan berkurangnya air maka konsentrasi zat terlarut dalam media akan meningkat, dengan meningkatnya konsentrasi zat terlarut akan meningkatkan tekanan osmotik sehingga akan menekan sel bakteri dan sel akan lisis

Isolasi bakteri
Isolasi atau pembiakan adalah proses menumbuhkan mikroorganisme dari tempat infeksi (lingkungan in vivo) melalui berbagai spesimen dan menumbuhkan dalam lingkungan tiruan di laboratorium (lingkungan invitro). Ketika bakteri tumbuh pada media, pada umumnya populasi bakteri akan mudah diamati tanpa mikroskop karena berada dalam jumlah yang banyak berupa koloni bakteri sehingga memungkinkan untuk identifikasi laboratorik selanjutnya . Keberhasilan pemindahan bakteri dari lingkungan in vivo ke in vitro memerlukan nutrisi dan lingkungan yang dibutuhkan oleh bakteri patogen tersebut. Karena pada lingkungan in vivo bakteri dapat menggunakan berbagai hasil metabolik dan jalur fisiologik untuk pertumbuhan selama berada di dalam tubuh hospes kemudian secara tiba-tiba harus dapat menyesuaikan diri dengan kondisi tiruan di laboratorium. Dengan demikian sangatlah penting untuk menyediakan nutrisi yang dibutuhkan dan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan bakteri
Di dalam tubuh, populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam jenis bakteri untuk memisahkan bakteri patogen perlu dilakukan isolasi di laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
Untuk memperoleh hasil yang baik dalam pertumbuhan bakteri maka perlu cara kerja yang aseptik, dan sterilisasi ose sebelum digunakan mengambil koloni yang dicurigai sebagai penyebab infeksi.
Inkubasi
Metode-metode yang digunakan untuk mengoptimalkan kondisi inkubasi :
*inkubasi dilakukan pada suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri (35⁰C-37C) dan kelembaban udara yang mengandung CO2 sekitar 3-5%
*untuk pertumbuhan bakteri yang memerlukan CO2 lebih banyak diperlukan inkubasi pada tempat khusus yang mengandung CO2 (tablet natrium bikarbonat dengan kelembaban dan penutupan yang sangat erat akan menghasilkan CO2 yang cukup , sebagai alternatif dapat juga dilakukan inkubasi pada sungkup lilin yang dapat menghasilkan CO2 3%
Identifikasi bakteri
Setelah isolasi, bakteri yang tumbuh pada media perbenihan dilakukan identifikasi dengan tahapan sebagai berikut:
1) Evaluasi morfologi koloni
Evaluasi morfologi koloni dengan memperhatikan warna koloni, bentuk koloni (seperti titik, bundar, berfilamen,atau tidak beraturan), elevasi koloni (cembung, cekung, datar), serta batas koloni (halus atau tidak beraturan)
2) Pemeriksaan mikroskopis
Pemeriksaan mikroskopis dengan cara pewarnaan gram dengan melihat diferensiasi (termasuk bakteri gram positif atau negatif), bentuk (coccus, batang, koma, atau pleimorf), susunan (sendiri-sendiri, diplo, berantai, atau seperti anggur)
3) Uji biokimia
Uji biokimia dilakukan untuk melihat karakteristik bakteri melalui reaksi biokimia, yang biasa dilakukan diantaranya:
1. TSIA (Tripel Sugar Iron Agar)
Digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif batang, untuk melihat kemampuan meragi glukosa dan sukrosa atau laktosa. Contohnya hasil untuk Escherichia coli (acid/acid), Salmonella thypii (alkali/acid+H2S) sedangkan Pseudomonas aerugenosa (alkali/alkali)
Gambar 5. Hasil uji pada TSIA
2. Fermentasi karbohidrat/gula-gula
Gambar 6. Hasil positif (tabung berwarna kuning) fermentasi gula-gu
3. MR/VP (methyl red /voges proskauer)
Uji ini dilakukan untuk menentukan organisme yang memproduksi dan mengelola asam dan produk-produknya dari hasil fermentasi glukosa, memperlihatkan kemampuan sistem buffer dan menentukan organism yang menghasilkan prosuk netral (asetil metal karbinol atau aseton) dari hasil fermentasi glukosa
Gambar.7 hasil uji MR(kiri) dan VP(kanan)
4. SIM(sulfur, indol, motility)
Uji ini untuk mengetahui pergerakkan bakteri, produksi indol dan pembentukkan gas H2S
Gambar 8. Hasil uji pada media SIM
5. Simon citrate
Uji ini dilakukan untuk menentukkan bakteri yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon







BAB I
PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang
Di dalam bidang ilmu mikrobiologi, untuk dapat menelaah bakteri khususnya dalam skala laboratorium, maka terlebih dahulu kita harus dapat menumbuhkan mereka dalam suatu biakan yang mana di dalamnya hanya terdapat baktri yang kita butuhkan tersebut tanpa adanya kontaminasi dari mikroba lain. Biakan yang semacam ini biasanya dikenal dengan istilah biakan murni. Untuk melakukan hal ini, haruslah di mengerti jenis- jenis nutrien yang disyaratkan bakteri dan juga macam ligkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhan bakteri tersebut (Pelczar, 1986).
Selain teknik pertumbuhan bakteri atau teknik isolasi di atas, dikenal juga adanya teknik isolasi mikroba yaitu inokulasi yang merupakan suatu teknik pemindahan suatu biakan tertentu dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tujuan untuk mendapatkan suatu biakan yang murni tanpa adanya kontaminasi dari mikroba yang lain yang tidak diiinginkan.
Berdasarkarkan hal tersebut di atas maka dilakukanlah praktikum ini untuk mengetahui teknik dari isolasi dan inokulasi bakteri.
I.2 Tujuan Percobaan
Adapun tujuan dari percobaan ini adalah :
- Mengetahui teknik isolasi mikroba di sekitar kita (isolasi mikroba dari kotoran gigi, isolasi mikroba dari kulit kepala dan isolasi mikroba dari kotoran belakang leher) serta isolasi mikroorganisme dari substrak cair, isolasi dengan cara penuangan, taburan, substrak padat,agar tegak dan miring.
- Mengetahui taknik pemindahan/ inokulasi biakan mikroorganisme
- Mengetahui ciri pertumbuhan dari mikroorganisme pada media agar.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Populasi mikroorganisme yang ada di alam sekitar kita ini ssangatlah besar dan cukup kompleks. Beratus spesies mikroba menguasai setiap bagian tubuh kita. Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup basar. Sebagai contoh, sekali kita bersin dapat mnebarkan beribu- ribu mikroorganisme. Satu gram tinja dapat mengandung jutaan bakteri. Alam di sekitar kita, baik itu tanah, air, maupunudara juga dihuni oleh kumpulan mikroorganisme.Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini, atau yang biasanya dikenal dengan istilah biakan campuran, menjadi spsies yang berbeda- beda yang bikenal dengan istilah biakan murni. Biakan murni in teerdiri dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk (Pelczar, 1986).
Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, suubstrat yang berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri, khamir, kapng dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di linkungan ini sangatlah beraneka ragam sehinga dalam mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk menngisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten terhadap suatu antibiotik. Atau untuk mengetahui mikroba yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992).
P emindahan bakteri dari medium lama ke medium yang baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini memerluakn banyak ketelitian. Terlebih dahulu kita harus mengusahakan agar semua alat- alat yang akan digunakan untuk pengerjaan medium dan pengerjaan inokulasi benar- benar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kkontaminasi, yaitu masuknya mikrooba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh di dalam medium adalah benar- benar biakan murni (Dwidjoseputro, 1990).
Di dalam keadaaan yang sebenarnya dapat dikatakan bahwa tidak ada bakteri yang hidup secara tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. Kerap kali bakteri patogen kedapatan bersama- sama dengan bakteri saprob. Untuk menyendirikan suatu spesies dikenal beberapa cara, yaitu (Dwidjoseputro, 1990) :
1. Degan pengenceran
Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Ia berhasil memelihara Streptococcus lactis dalampiraan murni yang diisolasi dari sampel susu Yang sudah masam.
Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam mdium tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika kita belum yakin, Bahwa koloni tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang murni, maka kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.
2. Dengan penuangan
Robert Koch (1843- 1905) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil sedikti sampel campuran bakteri yang mudah diencerkan, dan sampel ini kemudian di sebar di dalam suatu medium yang terbuat dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian dia memperoleh suatu piaraan adukan. Setelah medium tersebut mengental maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni- koloni yang masing- masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan di atas, maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin.
Ada beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam biakan di dalam medium diantaranya adalah (Lay, 1994) :
1. Metode cawan gores
Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjafi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel yang digores.
2. Metode cawan tuang
Cara lain untuk mempeeroleh biakan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. Karena konsentrasi sel- sel mikroba di dalam eksperimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang- kurangnyya satu di antara cawan – cawan tersebut mengandung koloni- koloni terpisah baik di atas permukaan maupun di dalam agar. Metode ini memboroskan waktu dan bahan namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi.
Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal dengan Isolasai Mikroba. Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu (Admin, 2008) :
1) Isolasi pada agar cawan
Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar cawantuang.Metode gores kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satusel.
Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di dalamcawan.
2) Isolasi pada medium cair
Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.
3) Isolasi sel tunggal
Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.
BAB III
METODOLOGI
III. 1 Alat
Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah cawan petri, bunsen, enkas, ikubator, ose dan mikropipet.
III.2 Bahan
Bahan yang dipergunakan pada percobaan ini adalah Biakan Escherichia coli, Biakan Staphylococcus aureus, biakan Lactobacillus, Larutan tanah, medium nutrient agar padat, aquadest, spiritus, alkohol, swab dan korek api
III.3 Cara Kerja
Adapun cara kerja dari percobaan ini adalah :
1. Isolasi mikroba di sekitar kita
- Cawan petri yang berisi medium NA diberi label masing- masing sesuai perlakuan.
- Kemudian dengan menggunakan swab, mengambil kotoran gigi, kotoran belakang leher, dan kotoran kulit kepala.
- Sebelum dilakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan menggunakan alkohol 70%.
- Setelah itu masing- masing sampel dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi medium NA.
- Melidahapikan mulut/ pinggir cawan petri dengan maksud agar bakteri yang melekat mati.
- Kemudian membungkus cawan petri dengan menggunakan kertas lalu menginkubasi ke dalam inkubator selama 24- 48 jam. Mengamti perubahan yang terjadi.
2. Isolasi mikroorganisme dari substrak cair
- Cawan petri yang berisi medium NA diberi label masing- masing sesuai perlakuan. Lalu memasukkannya kedalam enkas bersama dengan Biakan Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Lactobacillus pada media cair.
- Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol 70%.
- Mengambil masing- masing biakan bakteri dengan menggunakan mikropipet sebanyak 0,1 mL, lalu diratakan pada permukaan medium sesuai dengan label.
- Melidahapikan mulut/ pinggir cawan petri dengan maksud agar bakteri yang melekat mati.
- Kemudian membungkus cawan petri dengan menggunakan kertas lalu menginkubasi ke dalam inkubator selama 24- 48 jam. Mengamti koloni yang tumbuh.
3. A. Isoalsi dengan cara penuangan
- Cawan petri steril, masing- masing diberi label sesuai perlakuan lalu meletakkan di dalam enkas bersama dengan medium NA yang cair.
- Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol 70%.
- Mengambil masing- masing biakaan bakteri dengan menggunakan mikropipet sebanyak 1 mL.
- Melidahapikan cawan petri terlebih dahulu kemudian memasukkan biakan bakteri ke dalam cawan petri steril lalu menuangkan medium NA cair.
- Menutup cawan petri kemudian melidahapikan dann menggoyangkan dengan cara memutar agar merata.
- Medium setelah padat lalu menginkubasi sdelama 24- 28 jam dengan posisi terbalik pada suhu 37°C.
B. Isolasi dengan cara taburan
- Cawan petri yang berisi medium NA masing- masing diberi label sesuai perlakuan,lalu meletakkannya di dalam enkas.
- Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol 70%.
- Dengan menggunakan ose lurus, mengambil biakan bakteri lalu menaburkannya di atas medium NA padat secara merata.
- Menutup cawan petri lalu melidahapikan dan membungkus dengan kertas, menginkubasi selama 24-28 jam dengan posisi terbalik pada suhu 37°C.
4. Isolasi mikroorganisme dari substrak padat
- Memasukkan cawa petri steril ke dalam enkas, kemudian sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol 70%.
- Mengambil larutan tanah yang telah homogen dengan menggunakan mikropipet lalu memasukkannya ke dalam cawan petri steril lalu menuangkan medium NA.
- Menutup cawan petri lalu melidahapikan dan membungkus dengan kertas, menginkubasi selama 24-28 jam dengan posisi terbalik pada suhu 37°C.
5. Isolasi bakteri dari kultur campuran
- 4 buah tabung rreaksi yang masinng- masing berisi 2 medium agar tegak dan 2 medium agar mirig dimasukkan ke dalam enkas, setelah diberi label.
- Sebelum melakukan pengerjaan dalam enkas, terlebih dahulu mensterilkan tangan dengan mengunakan alkohol 70%.
- Dengan menggunakan ose lurus, mengambil biakan bakteri lalu menusukkan ke dalam medium lalu di tutup.
- Dengan menguunakan ose bulat, mengambil biakan bakteri dan masing- masing digoreskan secara zig- zag pada medium agar miring lalu di tututp
- Membungku tabung reaksi dengan kertas dan menginkubasinya selama 24- 72 jam dan mengamati masing- masing perbedaannya.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil
Tabel pengamatan :
1. Isolasi mikroba di sekitar kita
Asal mikroba Ciri- ciri koloni Kelompok mikroba
Bentuk Warna Tepi Permukaan
Kotoran gigi - Circular
-Irregular Putih -Entire
-Lobate Convex Bakteri
Kotoran kulit kepala -Circular
-Rhizoid Putih -Entire
-Filamentous Raised Bakteri
Kotoran Belakang leher -Circular Putih Entire Convex Bakteri
2. Isolasi mikroba dari substrak cair
Bakteri Ciri- ciri koloni
Metode
Warna Bentuk tepi Permukaan
Escherichia coli Putih kehijauan Irregular Lobate Raised Tabur
Eschericia coli Putih - - - Tuang
Keterangan : – = tidak jelas
3. Isolasi kultur campuran
Koloni Ciri-ciri koloni
Warna Bentuk Tepi Permukaan
1 Putih Circular Entire Raised
2 Putih Irregular Lobate Flat
Keterangan :
- Circular : Bulat
- Irregular : Tidak beraturan
- Rhizoid : Pertumbuhan dengan cabang- cabang tidak teratur seperti akar.
- Entire : Rata
- Lobate : Terdapat bentuk- bentuk seperti telinga
- Filamentous : Berbentuk lembaran- lembaran
- Convex : Cembung
- Raised : Pertumbuhan dengan cabang- cabang teratur
- Flat : rata, datar
VI.2 Pembahasan
1. Isolasi mikroba disekitar kita
Pada percobaan isolasi mikroba di sekitar kita, digunakan medium NA (Nutrient Agar) dengan mengisolasi mikroba yang berasal dari kiotoran giggi, kotoran kulit kepala, dan kotoran belakang lehet. Setelah melakukan pengerjaan dan di inkubasi selama 24- 28 jam di inkubator, diperoleh hasil bahwa cawan petri yang berisi mikroba dari kotoran kulit kepala berjumlah 21 koloni, memiliki dua macam bentuk koloni yaitu berbentuk circular (bulat) dengan tipe entire dan berbentuk irregular ( tidak beraturan) dengan tipe lobate. Warna kedua koloni putih dan memiliki permukaan convex (cembung).
Cawan petri yang berisi mikroba dari kotoran belakang leher berjumlah 24 koloni memiliki dua macam bentuk koloni yaitu filamentous. Warna kedua koloni putih dan memiliki permukaan raised.
Cawan petri yang berisi kotoran gigi berjumlah 26 koloni memiliki bentuk koloni circular (bulat) dengan tepi entire. Warna koloni putih dan permukaan convex.
2. Isolasi mikroba dari substrat cair
Pada percobaan isolasi mikroba dari substrat cair, dilakukan dengan metode tuang dan metode tabur menggunakan bakteri Escherichia coli. Setelah melakukan pengerjaan dan diinkubasi selama 24- 48 jam di inkubator, isolasi mikroba dengan metode tabur terdapat 8 koloni bakteri dengan bentuk irregukar, memiliki bentuk tepi lobate dan permukaan raised. Warna koloninya putih kehijauan.
Isolasi mikroba dengan metode tuang, bakteri yang berkoloni jumlahnya tidak bisa untuk dihitung (TBUD), bentuk bakteri,tepi, serta permukaannya tidak jelas. Sedangkan warna bakteri putih.
3. Isolasi bakteri kultur campuran
Pada percobaan isolasi bakteri dengan kultur campuran, setelah dilamkukan pengerjaan dan diinkubasi selama 24- 48 jam di inkubator, terdapat 12 koloni bakteri dengan dua macam bentuk bakteri dengan tepi dan permukaan berbeda.
Pada koloni pertama bentuknya Circular dengan bentuk tepi entire dan permukaan raised. Pada koloni kedua bentuknya irregular dengan bentuk tepi lobate dan permukaan flat. Warna kedua koloni bakteri putih.
4. Medium agar tegak dan agar miring
Pada percobaan ini digunakan agar tegak dan agar miring dengan menggunakan bakteri Escherichia coli. Setelah dilakukan pengerjaan dan di inkubasi selama 1-2 x 24 jam, pertumbuhan bakteri pada medium agar tegak berbentuk villous sedangkan pertumbuhan bakteri pada medium agar miring berbentuk beaded.
BAB V
PENUTUP
V.1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan yang diperoleh dari percobaan ini adalah :
1. Isolasi mikroba di sekitar kita, didapatkan ciri- ciri koloni berupa :
- Bentuk : Circular, irregular, dan rhizoid
- Warna : putih
- Tepi : Entire, lobate, Filamentous
- Permukaan : Convex, dan raised


2. Isolasi mikroba dari substrak cair, di dapatkan ciri- ciri koloni berupa :
- Bentuk : Irregular
- Warna : Putih, dan putih kehijauan
- Tepi : lobate
- Permukaan : Raised
3. Isolasi kultur campuran, di dapatkan ciri- ciri koloni berupa :
- Circular, dan irregular
- Warna : Putih
- Tepi : Entire, dan lobate
- Permukaan : Raised dan flat